Dezoito raparigas com fenótipo de RTT ou com algumas características de RTT, entre 16 meses e 16 anos, sem mutação identificada do gene MECP2 foram referenciadas de todo o país para estudo genético. Recolheram-se amostras sanguíneas das crianças e dos pais. Obteve-se a informação clínica através de questionários enviados aos Neuropediatras dos pacientes.
Os pacientes foram divididos em dois grupos: o grupo I (GI) inclui os doentes que preenchem os critérios diagnósticos de RTT, clássico ou atípico (n=12); e o grupo II (GII) inclui os que apresentam apenas algumas características de RTT (n=6).
Em 6 pacientes, com fenótipo de RTT congénito, pesquisou-se mutações no gene CDKL5.
Efectuou-se análise genética por micro-array (aCGH) e os resultados confirmados com real-time quantitative PCR (qPCR). Como controlos, usaram-se duas bases de dados (DB).
RESULTADOS
A idade mediana de diagnóstico foi de 35 meses.
No grupo analisado, dez pacientes preencheram os critérios clínicos para RTT: quatro com a forma congénita, quatro com early onset seizures, um com a forma fruste e um com RTT clássico.
Ao nascimento, todos tinham perímetro cefálico (PC). A desaceleração do crescimento da cabeça verificou-se em 53%, havendo cinco doentes com microcefalia adquirida (29,4%) e dois de macrocefalia. Apenas um doente apresentava baixo peso.
O desenvolvimento psicomotor nos primeiros 12 meses foi normal em apenas 27,8% dos casos. Verificou-se regressão/estagnação do desenvolvimento em 88,9%, ocorrendo numa idade mediana idades de 5 meses.
À idade de observação, 83,3% dos doentes tinham atraso mental severo e 55,6% contacto ocular intenso. Comportamento autista foi notado, numa idade mediana de 7 meses, em 83,3%.
Na amostra em estudo, 44% pronunciar palavras simples e 22% frases. Um paciente perdeu a capacidade de uso das palavras aos 25 meses.
O controlo cefálico foi atingido por todos os pacientes; 83,3% foram capazes de se sentar. A marcha independente foi adquirida por 61,1%, mas, entre estes, 81,8% têm marcha dispráxica. A capacidade de preensão de objectos foi adquirida por 83,3%, destes apenas 66,7% tinham propositada.
Estereotipias, adquiridas numa idade mediana de 30 meses, estavam presentes em 94,4% dos pacientes e as estereotipias manuais, em particular, em 88,2%. Mais de um tipo de estereotipias são observadas em 76,5% dos doentes, e 53% têm estereotipias de outras partes corporais. A frequência das estereotipias é pequena (raramente) em
40% dos pacientes e em 40% ocasionalmente, sendo constantes em apenas em 10%. Bruxismo foi referido em 62,5% dos casos.
Síndrome piramidal e atrofia neurogénica estavam presente em 38,9% dos pacientes e 22,2% tinham ataxia.
Também foram descritas dificuldades na mastigação, em 33,3%, e distúrbios respiratórios, em 29,4%. Distúrbios periféricos vasomotores estavam presentes em 46,8%. Cifoscoliose/cifose alta foram reportadas em 50% dos casos.
Epilepsia foi registada em 55,6%. A idade mediana de início das convulsões foi de 6 meses e o controlo destas foi atingido em 77,8% dos casos.
Apenas duas raparigas atingiram o controlo de esfíncteres, 72,2% tinham alterações do comportamento e 38,9% distúrbios do sono.
Da investigação adicional que foi previamente levada acabo nestes doentes, em apenas quatro casos (pacientes 4, 8, 13, 14) foram encontradas alterações, nomeadamente a nível de RMN e TAC cerebrais, com atrofia cortical e défice de migração neuronal.
Considerando os resultados genéticos, há alguns casos para os quais as aCGH não revelaram alterações genómicas significativas, nomeadamente para as pacientes 1, 2, 4, 8, 9, 11 e 12.
Para os pacientes 3, 6, 7, 14 e 16 encontraram-se alterações, representadas na Tabela 3., no entanto verificou-se que também estavam presentes nos pais das crianças. Nos outros casos (5, 10, 13), as alterações encontradas, apesar de não se ter conseguido confirmar a sua presença nos pais, foram consideradas benignas.
Na paciente 15, foi detectada uma delecção dos exões 1 2 2 do gene MECP2 e das pacientes propostos para sequenciação do CDKL5 (n=6), apenas duas tinham este gene mutado: pacientes 17 e 18.
DISCUSSÃO
Houve várias questões acerca da clínica dos pacientes que não foram respondidaspor todos os Neuropediatras. Esta falta de dados em alguns parâmetros influenciou os resultados deste estudo.
As alterações encontradas por aCGH foram consideradas benignas, sendo que maioria destas foram herdadas dos pais.
Na paciente 1 encontrou-se uma alteração que envolve o gene TUBA8. Este é expresso, em baixo nível, no cérebro humano em desenvolvimento, sendo que a sua mutação está associada a uma condição conhecida como polimicrogíria.
A duplicação encontrada na paciente 3, herdada da mãe, envolve dois genes com implicações a nível do Sistema Nervoso Central: o DDR1 comparticipação na histogénese do córtex cerebelar; e o GTF2H4 que parece ter associação com a Esclerose Múltipla.
Na paciente 5, foi detectada uma delecção envolvendo o gene GLIS3, cuja mutação bialélica foi associada a diversas patologias como diabetes neonatal, hipotiroidismo, porém, esta criança não apresentou, até à data, características que sugiram qualquer uma dessas doenças.
As alterações encontradas nos paciente 6, 7, e 16 foram todas consideradas não patogénicas. A duplicação descoberta no paciente 10, será provavelmente benigna, conclusão tirada a partir da análise das alterações reportadas nas DBs.
Na criança 13, a alteração descoberta envolve a região do gene ATP12A2, confirmando-se por qPCR que este gene, no entanto, estava normal, sendo que as restantes regiões afectadas pela delecção estavam cobertas por controlos. Razões pelas quais esta alteração foi considerada benigna. O gene ATP12A2 está associado a uma forma de Parkinson, doença com algumas similaridades com o RTT.
Na paciente 14, encontrámos três mutações benignas. Dos genes envolvidos, um dos mais relevantes para a patologia em estudo será o DRD3, que poderá participar na função executiva e nos processos da memória de trabalho. Outro importante gene implicado é o HUWE1 - um cerebelo Huwe1-null exibe uma perturbação ao nível da diferenciação dos precursores dos grânulos cerebrais neuronais e uma disfunção da organização da glia, que, por sua vez, pode prejudicar a migração neuronal. Apesar deste polimorfismo parecer benigno, isto pode ser particularmente interessante, tendo em conta os achados na RMN desta paciente, compatíveis com défice de migração neuronal.
Todas estas alterações foram consideradas benignas, contudo a possibilidade destes genes desempenharem um papel patogénico no fenótipo clínico RTT-like e das crianças com RTT atípico não pode ser excluída definitivamente.
A mutação MECP2 encontrada no caso 15 e não detectada previamente alerta- nos para a possibilidade de falsos negativos e de erros na análise genética. Além disso, reforça a fiabilidade dos critérios clínicos, que aliás indicam que esta criança é um RRT clássico.
Todas as pacientes nas quais se pesquisou a mutação CDKL5 preenchiam os critérios clínicos para RTT atípico. Contudo, apenas duas tinham a mutação. Ambas desenvolveram convulsões epilépticas precoces e apresentavam um tipo de epilepsia que não está presente em nenhum outro caso deste estudo: espasmos. Este achado corrobora que o principal factor que nos põe na pista de uma mutação do gene CDKL5 é o surgimento precoce de crises epilépticas (por volta dos três meses ou antes)
Comparando os doentes estudados neste trabalho com um grupo descrito por Temudo et al (2011) com mutação do gene MECP2 verifica-se que a fase de regressão/estagnação ocorre mais cedo e há maior incidência de desenvolvimento anormal no primeiro ano de vida entre os pacientes com RTT atípico ou RTT-like. Nestes doentes, não há um período de regressão tão evidente como nos RTT clássico.
Em ambos os grupos, há uma incidência similar de traços autistas, contudo, em pacientes sem mutação MECP2 são notados mais cedo. A proporção de pacientes com marcha independente e com epilepsia são similares nos dois grupos. O controlo das crises epilépticas parece mais fácil de ser conseguido nos pacientes sem mutação
MECP2.
Os doentes com mutação MECP2 executam uma maior variedade de estereotipias, têm melhor contacto visual, maior incidência de microcefalia adquirida, distúrbios respiratórios e vasomotores periféricos.
Assim, é mais fácil perceber que estas crianças têm uma apresentação diferente daquelas com mutação MECP2, não apresentando muitas características típicas de RTT.
A principal conclusão que se pode tirar deste estudo é que as características clínicas são o aspecto mais relevante no RTT, inclusivé, direccionando a investigação
genética de uma forma fidedigna. Além do mais, os novos critérios diagnósticos de RTT mostraram ser confiáveis, possibilitando um diagnóstico correcto, tal como se verificou no caso 15.