Animais Experimentais e Avaliação de Parâmetros Metabólicos. Para o estudo foram utilizados ratos Wistar, camundongos Swiss, camundongos Nude, camundongos C57BL6 e ainda camundongos knockout para o receptor da interleucina 17 (KO IL17RA). A colônia dos KO IL17RA foi estabelecida a partir de matrizes gentilmente cedidas pelo Professor João Santana da Silva da Universidade de São Paulo, campus Ribeirão Preto.
Os camundongos C57BL/6J foram utilizados como controle dos KO IL17RA, seu background genético, provenientes do Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas (CEMIB UNICAMP). Foram acomodados 5 animais por caixa, sob condições padronizadas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas) e temperatura de 22 ± 2 °C, com água e alimentação ad libitum. Todos os experimentos foram iniciados com animais após a 5º semana de vida. Para os experimentos onde os animais receberam dietas diferentes os mesmos foram separados aleatoriamente em grupos e alimentados com dieta comercial padrão (Nuvilab®) ou dieta hiperlipídica (Tabela 1) durante 5 semanas. Desta forma, os grupos experimentais foram:
- Animais C57 em dieta padrão (CT Chow). - Animais C57 em dieta hiperlipídica (CT Hf).
- Animais Ko IL17R em dieta padrão (IL17RA KO Chow). - Animais Ko IL17R em dieta hiperlipídica (IL17RA KO Hf).
Em todos os experimentos foram seguidas as recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa Animal.
Esses grupos tiveram parâmetros metabólicos avaliados durantes 5 semanas. Semanalmente realizamos medidas de peso, ingestão alimentar e glicemia após quatro horas de jejum. Na quarta semana experimental foi realizado um teste de tolerância à glicose intraperitoneal (GTTip).
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O GTTip é realzado após 8 horas de jejum, a glicemia caudal foi mensurada (t=0) e, em seguida, foi administrada uma solução de 25% de glicose (2g/Kg de peso) na cavidade peritoneal dos animais. As glicemias foram determinadas 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração de glicose. Os resultados obtidos foram utilizados para o cálculo da área sob a curva (AUC).
Tabela 1. Composição dos Macronutrientes das Dietas Experimentais.
*
Comercial, Nuvilab®
# Modificada para hiperlipídica, contendo 35% de lipídios.
Imunoneutralização da IL17. Em experimentos de imunoneutralização da IL17 nós utilizamos anticorpo anti-IL17 (polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology, SC-6077). Camundongos C57Bl6 foram separados randomicamente e tratados com veículo (soro IgG anti-rabbit )ou
anticorpo anti-IL17 (2,5g) via intraperitoneal, duas vezes por semana durante quatro semanas.
Durante o período experimental nós avaliamos semanalmente o peso, ingestão alimentar, glicemia de jejum e ao final na quarta semana experimental realizamos um teste de tolerância à glicose (GTT).
Componentes Dieta Controle* Dieta Hiperlipídica#
g/ 100 g Kcal % g/ 100 g Kcal %
Proteínas 20 80 20 80
Carboidratos 62 248 45 180
Lipídios 4 36 35 315
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Inibição farmacológica da IL17. Nos experimentos de inibição farmacológica da IL17 nós utizamos o ácido ursolico (UA) (Sigma-Aldrich, U6753). Camundongos C57Bl6 foram separados randomicamente e tratados com veículo (óleo de soja) ou ácido ursolico (2,0 mg) por gavagem, duas vezes por semana durante quatro semanas. Durante o período experimental nós avaliamos semanalmente o peso, ingestão alimentar, glicemia de jejum e ao final na quarta semana experimental realizamos um teste de tolerância à glicose (GTT).
Estímulo com IL17 recombinante. O experimento realizado com administração de IL17 recombinante (Sigma-Aldrich, I4026) teve como objetivo avaliar o efeito dessa citona na glicemia. Para isso nós utilizamos camundongos C57Bl6, os quais foram separados randomicamente e estimulados com uma dose única de veículo (salina) ou peptídeo recombinante da IL17 (0,5 g), via intraperitoneal. Uma hora após o estímulo a glicemia foi mensurada (T=0), e após a medida T=0 aferimos novamente a glicemia 15, 30, 60, 90 e 120 minutos.
Elisa. Para as medidas de homônios e citocina por Elisa utilizamos ratos Wistar por conta do volume de soro necessário para a realização do ensaio. Os animais experimentais com seis semanas de vida foram randomicamente separados em três grupos: glicose por gavagem (75mg/kg), glicose intravenosa (2,0 mg/g, via jugular) ou alimentação. Os animais do grupo alimentado foram subdivididos em jejum overnight, realimentados durante uma hora, 15, 30, 60, 90,120 e 150 minutos de jejum após a realimentação.
Os animais foram anestesiados com Tiopental sódico e após teste negativo para dor, dos reflexos corneano, caudal e pedioso, estes foram decapitados e o sangue foi coletado. Para obtenção do soro o sangue foi centrifugado em temperatura ambiente a uma rotação de 3.000 rpm por 10 minutos.
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O soro foi utilizado para analise da concentração de insulina, (Millipore EZRMI-13K), GLP1 (Millipore #EGLP-35K) e IL17 (Biolegend #437907) através de kit de Elisa conforme instruções do fabricante.
Preparação do Intestino. Foram utilizados animais com seis semanas de vida para esses experimentos. Após uma dose letal de anestésico todo o inestino foi exposto e fragmentos do estomago, duodeno, jejuno, íleo e colon foram removidos. As corretas localizações anatômicas de cada região intestinal foram realizadas com a ajuda de um atlas anatômico. As amostras de tecido foram homegeneizados em Trizol e preparadas para avalizaçãod da expressão gênica por meio de PCR em Tempo Real.
Preparação do Pâncreas. Nos experimentos com o tecido pancreático foram utilizados animais com seis semanas de vida e embriões nos dias E15,5 e E18,5 de desenvolvimento embrionário. Após uma dose letal de anestésico o pâncreas foi removido e fixado em paraformoldeído (4% em PBS) para analises histológicas. Para a extração do pâncreas dos fetos utilizamos uma lupa para melhor visualização do tecido.
Reação de transcrição reversa. A fita-molde de cDNA foi obtida através de uma reação de transcrição reversa. Para tanto, as amostras de RNA foram submetidas a uma seleção do RNAm, utilizando-se um oligonucleotídeo poli dT, e posteriormente à transcrição com a enzima transcriptase reversa. O cDNA obtido foi utilizado na reação do PCR em tempo real.
PCR quantitativo (qPCR) – Real Time PCR. As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Utilizamos primers da empresa IDT Biosystems (IL17, mm PT586531092 and GLP1, mm PT5821875990).
O gene GAPD (TaqManTM - Applied Biosystems) foi o controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD está marcada com o fluoróforo VIC.
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Antes de se iniciarem os experimentos de quantificação relativa da expressão de qualquer gene, foi feita a validação do sistema para os genes acima e para o controle endógeno (GAPD), a fim de se verificar se as eficiências de amplificação de ambos os genes foram semelhantes e próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de interesse. A validação consiste na amplificação, tanto com os primers do gene de interesse quanto do controle endógeno, dos cDNAs de triplicatas de 7 concentrações diferentes (diluições seriadas de 3 vezes) de uma amostra escolhida aleatoriamente. Em seguida, foi construída uma curva padrão a partir do logaritmo da concentração das amostras pelo Ct (Threshold Cycle: ciclo em que cada curva de amplificação atravessa o limiar de detecção, o qual é definido arbitrariamente). Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva e da confiabilidade das réplicas (R2). Dessa forma, a eficiência de um sistema é calculada através da fórmula: E = 10(-1/slope) -1. Para a placa de validação dos genes foram feitas triplicatas da amostra de cDNA de hipotálamo referentes aos tratamentos citados acima em 7 concentrações diferentes.
Após o cálculo das eficiências de amplificação do gene de interesse e do controle endógeno, foi construído um gráfico de dispersão, o qual tem por finalidade definir qual é a amplitude de concentrações para as quais o sistema é eficiente. Para a construção do gráfico, foram utilizados os mesmos valores de logaritmo da concentração das amostras no eixo X e a diferença entre as médias dos Cts do controle endógeno e as médias dos Cts do gene de interesse para cada concentração no eixo Y. A seguir, obtém-se uma linha de tendência para estes valores, a qual possui uma equação de reta na qual é possível verificar o valor da inclinação desta reta. Para que um sistema seja considerado eficiente, o valor da inclinação deve ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor, menor é a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as médias dos controles do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico, correspondentes às concentrações,
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que estiverem mais próximos à linha de tendência são considerados validados (o sistema tem 100% de eficiência nestas concentrações).
Para a quantificação relativa dos genes em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 6,25μL de TaqMan Universal PCR Master Mix 2x, 0,625μL da solução de primers e sonda, 1,625μL de água e 4,0μL de cDNA, sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 μL de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50oC por 2 minutos, 95oC por 10 minutos e 40 ciclos de 95oC por 15 segundos e 60oC por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems).
Histologia. Os pâncreas foram dissecados, pesados e fixados de paraformaldeído (4%) Posteriormente, os tecidos foram desidratados em concentrações crescentes de álcool, diafinizados e incluídos em parafina. Secções histológicas de 5 μm foram obtidas em micrótomo rotativo utilizando-se navalhas de aço e aderidas em lâminas de vidro previamente tratadas com polilisina. As lâminas foram, então, incubadas por 2 horas a 60°C, desparafinizadas em xilol, reidratadas em concentrações decrescentes de álcool (100, 95 e 70%) e finalmente colocadas em banho com água destilada.
Hematoxilina-eosina. Os cortes foram corados com Hematoxilina de Ehrlich seguido de eosina.
Imunoflorescência. Após a fixação dos cortes, as lâminas foram lavadas com PBS. Em seguida, foi realizado o bloqueio das ligações inespecíficas do anticorpo com solução de leite desnatado 5% em PBS, as lâminas ficaram encubadas durante 1 hora em câmara úmida à temperatura ambiente. Realizado o bloqueio, as lâminas foram submetidas à marcação dupla utilizando anticorpos primários específicos (insulina, glucagon, CD11b, CD4, CD8, PDX1, MafA, Nkx2.2 e Ngn3), para tal as lâminas foram incubadas com solução de anticorpo primário diluído em leite desnatado 1% em PBS, em câmara úmida, overnight a 4º C. Após a reação primária, as lâminas foram incubadas, durante 2 horas e na ausência de luz, com anticorpos secundários
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específicos conjugados com TRITC, para o anticorpo anti-insulina, e FITC, para os anticorpos anti glucagon, CD11b, CD4 e CD8. Na seqüência as lâminas foram montadas utilizando glicerol. Análise e documentação dos resultados foram realizadas utilizando o microscópio confocal de imunofluorescência Leica.
Isolamento de ilhotas e screção estática de insulina. As ilhotas foram isoladas pela digestão do pâncreas com colagenase como descrito previamente (Rafacho A. et al., , 2007). Para a secreção estática grupos de cinco ilhotas foram incubados em diferentes concentrações de glicose e adicionamos IL17 no meio. O sobrenadante foi coletado depois de 60 minutos para a quantificação da concentração de insulina por radioimunoensaio descrito previamente descrito por Rafacho A. em 2008.
Estudos metabólicos com Humanos. Os experimentos com humanos foram aprovados pelo comitê de ética de estudo com humanos da Universidade de Campinas (#801/2008). Todos os trinta e três participantes assinaram um termo de concentimento (11 Lean, 11 Obese with no type 2 diabetes and 11 Obese with type 2 diabetes). Os pacientes foram submetidos a um teste de refeição padrão (MTT), todos os detalhes clínicos estão presentes na Tabela 2.
Table2. Dados Clínicos dos Pacientes.
Parametros Magros Obesos Obeso – DM
Genero 11F 11F 11F Idade (anos) 44.5±3.2 40.3±2.4 44.8±2.7 Peso (Kg) 61.1±2.5 87.0±4.7 90.2±3.6 IMC(Kg/m2) 23.4±0.8 33.1±1.2 35.8±1.3 Massa adiposa (Kg) 18.9±1.1 34.4±2.2 36.4±2.2
58 Glicemia de Jejum (mg/dl) 78.7±5.5 84.5±4.0 159.0±26.4 Insulina (ng/ml) 4.3±0.7 11.6±1.7 14.7±2.8 HbA1c (%) 5.0±0.2 5.2±0.1 8.4±0.8
IMC, Indice de massa corpora; HbA1c, hemoglobina glicada.
Teste de refeição padrão (MTT - MealTolerance Test). Um cateter venoso foi colocado na região antecubital e este foi utilizado apenas para coleta de sangue. O paciente permaneceu em repouso absoluto por pelo menos 5 minutos antes da primeira coleta de sangue. Após 12 horas de jejum, os pacientes receberam uma refeição padrão, composta por 237 ml de Ensure Plus HN e 1 Animal Bar (40g). O total calórico e os conteúdos de gordura, carboidrato e proteína da refeição serão respectivamente 521,5 Kcal, 31,6%, 49,4% e 19% e esta foi ingerida em até 10 minutos. O início da ingestão foi considerado tempo zero. O voluntário permaneceu sentado ou deitado durante todo o período do teste.
Amostras de sangue foram coletadas nos tempos -30, -15, 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, e 180 minutos. Foram utilizados para a coleta os seguintes tubos: tubos secos (sem reagente) e
tubos com EDTA K3, EDTA K3 com aprotinina (Trasylol – A-6012, Sigma) e EDTA K3 com
diprotina A (Ile Pro Ile – I-9759, Sigma). Os tubos secos permaneceram em temperatura
ambiente por 30 minutos e em seguida foram colocados no gelo ou refrigerados. Os demais tubos foram colocados imediatamente no gelo ou refrigerados e posteriormente centrifugados por 15 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi separado em tubos com tampa, em alíquotas de 1ml, e armazenados a – 20 ou - 80 ºC.
Estudo com ilhotas humanas. Um grupo de 100 ilhotas pancreáticas isoladas de 6 doadores humanos foram mantidas em cultura em um meio de cultura que contém 5.5 mM de glicose. As ilhotas foram tratadas com salina ou IL17. Após 48 horas o sobrenadante foi retirado para a
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quatificação da concentração de insulina como descrito por Grieco F. A. em 2014. Os dados clínicos dos doadores das ilhotas estão apresentados na Tabela 3.
Table3. Dados Clínicos dos Doadores de ilhotas. Doadores Genero Idade (anos) IMC
(Kg/m2) -pureza celular (%) Death cause D1 F 78 23 55 Cerebral hemorrhage D2 M 68 27 42 Cerebral hemorrhage D3 F 76 25 30 Cerebral hemorrhage D4 F 75 29 24 Heart infarction D5 M 69 25 85 Heart infarction D6 M 85 25 39 Cerebral hemorrhage Means ± SEM - 75 ± 2 25 ± 0.8 46 ± 21
IMC, Indice de massa corporal.
Análise Estatística. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. A comparação estatística foi realizada através da análise de variância (ANOVA) seguida pelo método de Bonferroni para comparações múltiplas (GraphPad Prism, versão 5.0). Foi adotado o nível de significância p<0,05.