A colheita das amostras foi realizada pela Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP), órgão estadual de São Paulo que realiza a recepção e distribuição do pescado para os elos que compõem a cadeia produtiva do pescado: mercados municipais, supermercados, feiras livres, entrepostos e indústrias, localizados em diferentes regiões do Estado de São Paulo, inclusive a Baixada Santista.
A Região Metropolitana da Baixada Santista é composta por nove cidades, sendo elas: Bertioga, Cubatão, Guarujá, Itanhaém, Mongaguá, Peruíbe, Praia Grande, Santos e São Vicente e conta com cerca de 1.4 milhões de habitantes (IBGE, 2000). Esta região também é conhecida como Costa da Mata Atlântica e tem grande importância histórica, econômica e turística em âmbito estadual, nacional e até mesmo internacional (CAZEIRO, 2004).
A importância econômica da Costa da Mata Atlântica está ligada também ao porto de Santos, que na atualidade, atende aos estados de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Goiás, e países do Mercosul. É hoje o maior porto do hemisfério sul em termos de infra-estrutura e movimentação de cargas e concentra cerca de um quarto dos produtos negociados pelo país no exterior. As indústrias de Cubatão são um dos principais pólos industriais do país, exercendo assim, papel fundamental na economia nacional (CAZEIRO, 2004).
Foram obtidas 92 amostras de forma aleatória. As colheitas foram realizadas durante o período da noite pelo veterinário chefe do CEAGESP durante a descarga da matéria- prima. O amostrador utilizou um “kit” de colheita constituído por caixa isotérmica, gelo gel, sacos plásticos, etiquetas, luvas, avental e touca. O pescado amostrado foi etiquetado, sendo as amostras numeradas e datadas.
O controle da origem do pescado foi feito com a obtenção de certificado sanitário e nota fiscal de produtor, que acompanha a carga até o CEAGESP.
A unidade amostral era um pescado na forma inteira. Estas foram transportadas do ponto de colheita do CEAGESP ao Laboratório de Anatomia Patológica do Instituto Biológico de São Paulo nos respectivos “kits” de colheita para realização das análises parasitológica e histopatológica.
Para a análise parasitológica foram elaboradas fichas para registro dos dados (Anexo 01). Também foi feita uma ficha de colheita (Anexo 02) que consistia de informações do estabelecimento (identificação do estabelecimento, nome fantasia, registro, endereço),
condições sanitárias do pescado (temperatura, conservação) e boas práticas de manipulação (higiene pessoal, vestimenta adequada).
Para realização da análise parasitológica foi feita necropsia pela linha média do pescado (Figura 03) e em seguida, os mesmos foram filetados para posterior análise em mesa de inspeção candling-table (Figura 04) para possível visualização de presença de larvas e/ou cistos de parasitas. Esta mesa contém na parte superior uma superfície de vidro fosco sobre uma fonte de luz fria de 1500 lux. Sobre o vidro foram colocados os filés cortados de forma a permitir a observação de parasitas por transparência.
b
f
g
d
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c
g
e
Figura 03. Visualização dos órgãos: fígado (a), estômago (b), coração (c),
Intestino (d), baço (e), mesentério (f) e testículos (g) de pescada durante necropsia.
Figura 04. Visualização de cisto (seta) em musculatura com utilização de candling-table.
Fonte: Arquivo do autor, 2008.
Os parasitos, quando encontrados vivos na cavidade abdominal ou na musculatura, foram colhidos com pinça anatômica e colocados em uma placa de Petri com água destilada. Após esse procedimento, os parasitos eram fixados em AFA (93 partes de álcool 70ºGL, cinco partes de formalina 37-40% e duas partes de ácido acético glacial) na temperatura de 65ºC para facilitar a sua identificação conforme preconizado por Amato et al. (1991). No entanto, quando os parasitos estavam mortos eram fixados diretamente em AFA. Quando encontrados cistos nas vísceras e mesentérios (Figura 05), estes foram rompidos e os parasitos encontrados removidos e fixados em AFA.
Figura 05. Presença de cistos (seta) no mesentério.
Fonte: Arquivo do autor, 2008.
Os parasitos nematódeos encontrados foram identificados conforme a técnica de Amato et al. (1991). O objetivo desta técnica é a clarificação do parasito para facilitar a sua identificação conforme descrito a seguir:
• Colocar os nematódeos vivos em placa de Petri com AFA a 65ºC; • Esfriar e deixar por 48 horas;
• Clarificar com lactofenol (50 partes de ácido lático, 25 partes de fenol cristalizado e 25 partes de água) para realizar adequada identificação;
• Realizar montagem do parasito entre lâmina e lamínula; • Observar em microscópio óptico comum;
• Fazer a foto documentação (10X e 20X); • Conservar em álcool 70%.
Durante a necropsia foram colhidos fígado, rim, baço, intestino, estômago, coração e musculatura para realização da análise histopatológica. Este material foi fixado em formol tamponado por um período de 24 horas e em seguida foram feitos os cortes dos tecidos, colocados em cassete para realização de desidratação e diafanização (Anexo 03).
Após realização de desidratação e diafanização, os tecidos foram emblocados e montados em lâmina conforme descrito a seguir:
• Adicionar parafina líquida no molde;
• Colocar o tecido no molde que contém a parafina líquida;
• Identificar o molde com o número da amostra, utilizando uma tira de papel com 3 cm de comprimento por 0,5 cm de largura;
• Colocar na geladeira após secagem da parafina líquida;
• Remover o bloco do molde e retirar o excesso com auxílio de faca; • Cortar no micrótomo com espessura de 4µm;
• Passar gelatina na lâmina;
• Colocar o fragmento em placa de petri com água; • Pescar o tecido com a lâmina;
• Esticar o corte em banho-maria à 50ºC;
• Deixar na estufa overnight para desparafinar e realizar a coloração requerida.
As colorações utilizadas foram de hematoxilina-eosina (anexo 04) pela técnica de Allen (1995) com a finalidade de observar a presença do parasito no pescado e suas alterações patológicas, e tricrômio de Masson (anexo 05) conforme descrito por Masson (1929) que auxilia a distinguir o colágeno do músculo e outros elementos histológicos (McELROY, 1995). As observações microscópicas foram registradas em ficha (Anexo 06) específica para comparar esses resultados com os encontrados na análise macroscópica.
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto Biológico (CETEA-IB) e registrado sob nº 043/08 atendendo aos princípios éticos preconizados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) (Anexo 7).
4. RESULTADOS
Das 92 amostras colhidas 56,52% (52/92) encontravam-se parasitadas (Gráfico 01), sendo 67,30% (35/52) do gênero Contracaecum (Figura 06), 30,76% (16/52) de Anisakis (Figura 07), 3,84% (2/52) de Pseudoterranova (Figura 08) e 9,61% (5/52) da ordem Trypanorhyncha (Figura 09, Gráfico 02). Agrupando apenas os anisaquídeos (gêneros
Anisakis, Contracaecum e Pseudoterranova), obteve-se 52,17% (48/92) de amostras
positivas.
57% 43%
Amostras Parasitadas
Amostras negativas para parasitas
Gráfico 01. Porcentagem de amostras positivas e negativas para parasitos.
0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% Contracaecum spp. Anisakis spp. Pseudoterranova spp. Trypanorhyncha In ci dê nc ia Espécies Parasitos
Figura 06. Observa-se através de microscopia óptica comum
parasita do gênero Contracaecum (A), extremidade anterior (B) e posterior (C). Aumento de 40 X.
Fonte: Arquivo do autor, 2009.