MATERIAL E MÉTODOS

Seleção dos táxons. — Foram analisados 51 acessos de Gurania, seis de Psiguria e um de Helmontia (ambos grupos-irmãos de Gurania). O grupo externo, representado por uma espécie de Doyerea, foi selecionado com base em filogenias da família (Kocyan & al., 2007; Schaeffer, Heibl & Renner 2009) e de Psiguria (Steele & al., 2010). As sequências de todos os espécimes de Psiguria, Helmontia, Doyerea e oito espécimes de Gurania (marcados com * na Tabela 1), foram utilizadas a partir de sequências depositadas no GenBank. Para as espécies de Gurania que apresentam ampla distribuição, plasticidade morfológica e difícil delimitação, mais de um espécime foi analisado, de forma a contemplar sua amplitude geográfica e morfológica. Todas as espécies utilizadas na filogenia foram revisadas do ponto de vista taxonômico e o nome adotado em cada terminal foi baseado no conceito atual de Gomes-Costa & al. (Cap. 3 e 4). A amostra-testemunho de cada um destes espécimes está citada na Tabela 1.

Extração, amplificação e Sequenciamento do DNA. — Foram utilizadas, em sua maioria, amostras de folhas conservadas em sílica gel e, poucas vezes, amostras herborizadas (quando coletadas há menos de 5 anos). O DNA genômico foi extraído a partir de amostras de folhas secas (20-50mg), utilizando-se modificações do protocolo CTAB, descrito em Ferreira & Gratapaglia (1995) ou o kit de extração DNeasy Plant DNA (Qiagen, Germantown, Maryland, USA), seguindo o protocolo do fabricante, exceto pela adição de 2-30 µl de betamercaptoetanol e 30 µL de proteinase K (2mg/ mL) na etapa 2, com posterior incubação overnight.

Tabela 1: Espécies e espécimes utilizados neste estudo

Espécie Designação na árvore a Localidade Voucherb

Doyerea emetocarthartica D. emetocarthartica* Antilhas Não disponível (M)

Gurania acuminata G. acum-PER 1 Peru Condon MC-182PE2012 (MOVC)

Gurania acuminata G. acum-PER 2* Peru Steele 1046 (TEX)

Gurania aff. bignoniacea G. aff. big-BRA(PE) 1 Pernambuco-BR Gomes-Costa, G. A. 266 (JPB)

Gurania aff. bignoniacea G. aff. big-BRA(PE) 2 Pernambuco-BR Gomes-Costa, G. A. 273 (JPB)

Gurania bignoniacea G. big-BRA(AL) Alagoas-BR Gomes-Costa, G. A. 322 (JPB)

Gurania bignoniacea G. big-BRA(PE) Pernambuco-BR Gomes-Costa, G. A. 277 (JPB)

Gurania bignoniacea G. big-BRA(SE) Sergipe-BR Gomes-Costa, G. A. 314 (JPB)

Gurania bignoniacea G. big-GUF 1 Guiana Francesa Condon FG04-231 (MOVC)

Gurania bignoniacea G. big-GUF 2 Guiana Francesa Condon 366-FG2011 (MOVC)

Gurania bignoniacea G. big-SUR Suriname Condon 35-SUR2011 (MOVC)

Gurania cogniauxiana G. cogn-BRA(RJ) Rio de Janeiro-BR Gomes-Costa, G. A. 414 (JPB)

Gurania costaricensis G. cost-CRI 1* Costa Rica Steele 1009 (TEX) Gurania costaricencis G. cost-CRI 2 Costa Rica Neill, A. K. CR 03-64 (BRIT)

Gurania diversifolia G. diver-GUF Guiana Francesa Condon FG04-123C/B (MOVC)

Gurania dumortieri G. dumor-BRA(BA) Bahia-BR Gomes-Costa, G. A. 350 (JPB)

Gurania dumortieri G. dumor-BRA(ES) Espirito Santo-BR Gomes-Costa, G. A. 365 (JPB)

Gurania eriantha G. eri-BRA(BA) Bahia-BR Gomes-Costa, G. A. 346 (JPB)

Gurania huberi G. hub-GUF Guiana Francesa Condon 112 (MOVC)

Gurania lobata G. lob-BOL 1 Bolívia Nee, M. & al. 53839A (NY)

Gurania lobata G. lob-BOL 2* Bolívia Steele 1045 (TEX)

Gurania lobata G. lob-BRA(PE) 1 Pernambuco-BR Gomes-Costa, G. A. 253 (JPB)

Gurania lobata G. lob-BRA(PE) 2 Pernambuco-BR Gomes-Costa, G. A. 287 (JPB)

Gurania lobata G. lob-PER 1* Peru Steele 1047 (TEX)

Gurania lobata G. lob-PER 2* Peru Steele 1048 (TEX)

Gurania lobata G. lob-PER 3 Peru Condon 39-PE2012 (MOVC)

Gurania lobata G. lob-PER 4 Peru Condon 13-PE2012 (MOVC)

Gurania makoyana G. mak-CRI Costa Rica Neill, A. K. s/n (BRIT)

Gurania neei G. neei-BRA(BA) 1 Bahia-BR Silva 289 (HUESB, JPB)

Gurania neei G. neei-BRA(BA) 2 Bahia-BR Ramos 15 (HUESB, JPB)

Gurania oxyphylla G. oxy-GUF Guiana Francesa Condon FG04-100 (MOVC)

Gurania pedata G. ped-ECU 2 Equador Neill, A. K. 3302 (BRIT)

Gurania pedata G. ped-ECU 1 Equador Swensen, S. B04-07 (Ithaca College)

Gurania pyrrhocephala G. pyrrho-ECU Equador Condon JS05-96 (MOVC)

Gurania pyrrhocephala G. pyrrho-PER* Peru Condon P05-77 (MOVC)

Gurania reticulata G. ret-GUF Guiana Francesa Condon FG04-1A (MOVC)

Gurania rhizantha G. rhiz-ECU Equador Neill, A. K 3300 (BRIT)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(BA) 1 Bahia-BR Lima, I. B. 1473 (JPB)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(BA) 2 Bahia-BR Gomes-Costa, G. A. 341 (JPB)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(BA) 3 Bahia-BR J Gomes-Costa, G. A. 353 (JPB)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(ES) 1 Espirito Santo-BR Gomes-Costa, G. A. 364 (JPB)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(ES) 2 Espirito Santo-BR Gomes-Costa, G. A. 366 (JPB)

Gurania sellowiana G. sellow-BRA(RJ) Rio de Janeiro-BR Gomes-Costa, G. A. 418 (JPB)

Gurania sinuata G. sinu-PER 1 Peru Neill, A. K. 3308 (NY)

Gurania sinuata G. sinu-PER 2* Peru Steele 1022 (TEX)

Gurania subumbellata G. sub-BRA(BA) Bahia-BR Gomes-Costa, G. A. 355 (JPB)

Gurania subumbellata G. sub-BRA(ES) Espirito Santo-BR Gomes-Costa, G. A. 362 (JPB)

Gurania subumbellata G. sub-GUF Guiana Francesa Condon FG04-120B (MOVC)

Gurania tricuspidata G. tric-BRA(ES) Espirito Santo-BR Gomes-Costa, G. A. 358 (JPB)

Gurania tubulosa G. tub-ECU Equador Susan, S. B04-38 (Ithaca College)

Gurania uei G. ulei-PER* Peru Condon P05-40B (MOVC)

Helmontia leptantha Helmontia leptantha* Guyana Clarke 9665 (US)

Psiguria pedata P. pedata* Republica Dominicana Steele 1036

Psiguria racemosa P. racemosa* Venezuela Steele 1018 (TEX)

Psiguria ternata P. ternata* Bolivia Steele 1043 (TEX)

Psiguria tryphylla P. tryphylla* Mexico Steele 1004 (TEX)

Psiguria umbrosa P. umbrosa* Trinidad Steele 1065 (TEX)

Psiguria warsceviczii P. warsceviczii* Costa Rica Steele 1006 (TEX)

a

Espécimes marcados com (*) indicam que as sequências utilizadas foram obtidas a partir do GenBank b

Herbários onde os espécimes utilizados estão depositados são citados entre parênteses

As análises filogenéticas foram realizadas com seis espaçadores intergênicos do DNA plastidial (ndhF-rpl32, psbE-petL, psbM-trnD, rpoB-trnC, rps16-trnQ e trnS-trnG) e o íntron do gene nuclear serina/treonina fosfatase (s/t phos) (tabela 2), selecionados com base na filogenia de Psiguria (Steele & al., 2010). Os primers utilizados foram os mesmos indicados por Steele & al. (2010) e, quando necessário, primers internos. Todas as regiões citadas foram amplificadas por PCR em um volume total de 25 µl, contendo 2.0 µl de amostra de DNA, 0.25 µl primer forward (20µM), 0.25 µl primer reverse (20µM), 0.5 µl dNTP mix (10mM cada dNTP), 5.0 µl GoTaq Reaction Buffer (green ou colorless) e 0.4 µl Taq Polimerase (GoTaq® DNA Polymerase, Promega, Madison, Wisconsin, USA), ou utilizando-se 12.5 µl GoTaq® qPCR Master Mix (alternativamente GoTaq® Green Master Mix 2X, ambos Promega, Madison, Wisconsin, USA), primers e DNA. As condições necessárias para os ciclos de PCR das seis regiões plastidiais foram: um ciclo de amplificação inicial com desnaturação a 96 ˚Cpor 3 minutos (min), anelamento a 61˚C por 45 segundos (s) e extensão a 72 ˚C por 1 min; seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94˚C por 35 s, anelamento por 45 s e extensão por 1 min; com extensão final a 72˚C por 12 min. Para o loco s/t phos, a PCR ocorreu com desnaturação a 96 ˚C por 3 min, anelamento a 49 ˚C por 45 s e extensão a 72˚C por 1 min; seguido por 35 ciclos de desnaturação a 95˚C por 35 s, anelamento a 49 ˚C por 45 s e extensão a 74˚C por 1 min; com extensão final a 72˚C por 12 min. As amplificações foram visualizadas em gel de agarose a 1%, corado com GelRedTM (Uniscience) e uma escala padrão foi utilizada para estimar a concentração e o tamanho dos fragmentos de DNA. Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit QIAquick®PCR Purification (Qiagen, Germantown, Maryland, USA). Cada amostra foi sequenciada em ambas as direções e o sequenciamento foi conduzido no Laboratório de Bioinformática e Biologia Evolutiva, UFPE (Recife, Pernambuco, Brasil), usando o sequenciador ABI 3500 (Applied Biosystems) ou na Macrogen Inc. (Seoul, Coreia), usando o sequenciador ABI 3730xl (Applied Biosystems). O alinhamento para cada conjunto de dados será depositado no banco de dados Tree Base e as sequências serão enviadas ao Genbank.

Análises Filogenéticas. — As sequências foram montadas e editadas no programa Geneious 7.1.8 (Biomatters Ltd.) e alinhadas automaticamente no MUSCLE (Edgar, 2004), seguidas de alinhamento manual. Cada região plastidial foi analisada independentemente assim como a região nuclear. A posteriori, foram realizadas análises concatenadas de todas as regiões plastidiais e também das regiões plastidiais somadas à região nuclear. Modelos de evolução para cada gene analisado e para as regiões concatenadas foram determinados no jModelTest2 (Darriba & al., 2012; Guindon & Gascuel, 2003), baseado no Akaike Information Criterion (AIC). A análise filogenética foi conduzida por Inferência Bayesiana (IB) e por Máxima Parcimônia (MP). A Inferência Bayesiana foi realizada de forma independente para cada loco e para todas as regiões concatenadas (todas as regiões plastidiais e todas as regiões plastidiais + nuclear). As análises foram conduzidas com base nos modelos evolutivos selecionados, utilizando-se o plug-in MrBayes 3.2.2 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001) no Geneious. A análise foi realizada com quatro corridas independentes para 10.000.000 de gerações e foram amostradas 5.000 árvores. Os primeiros 10% das árvores amostradas foram descartados como burn-in. As árvores subsequentes foram retidas e as probabilidades posteriores (PP) foram estimadas na árvore de consenso de maioria (corte de 50%).

A análise de Máxima Parcimônia foi realizada no PAUP* 4.0a146(x86), utilizando-se a concatenação das regiões plastidiais, a região nuclear e ambas concatenadas. Buscas heurísticas foram conduzidas usando 100 replicações com adição aleatória de sequências (random-sequence-addition replications) e o algoritmo TBR (tree-bisection reconnection), adotando-se os parâmetros nchuck = 1.000 e chuckscore = 215. A fim de evitar a retenção de um número exagerado de árvores sub-ótimas, apenas 1.000 árvores foram mantidas em cada replicação. Foram analisadas tanto a árvore de consenso estrito como a de consenso de maioria (corte de 50%). Para verificar o suporte relativo dos clados presentes nas árvores de MP foi realizado um teste de bootstrap (BS) com os mesmos parâmetros anteriores e 100 replicações.