4.1 DEFINIÇÃO E OTIMIZAÇÃO DAS CONSTRUÇÕES UTILIZADAS PARA OBTER VLPS
As sequências gênicas utilizadas para gerar as contruções do estudo foram obtidas da cepa HM175 (GenBank acesso: M14707), isolada a partir de um surto ocorrido na Austrália (COHEN et al., 1987). Para a obtenção de VLPs do HAV, foram definidas três estratégias, que incluem os genes das proteínas estruturais do vírus (VP1-4 e 2A) e proteases para a clivagem das mesmas. A primeira, HAV-PTRUNC (SOUSA, 2011), inclui todas as proteínas responsáveis pela formação do capsídeo viral (VP1, VP2, VP3, VP4 e 2A), além de uma região onde foram adicionadas sequências que codificam aminoácidos extras com a função de mimetizar os sítios naturalmente clivados pela protease 3C, juntamente com sequências espaçadoras. A inserção desta região foi uma tentativa de promover um processamento correto das proteínas virais e da protease viral 3C. Na segunda estratégia (P1+3C), duas construções distintas foram idealizadas, uma delas contendo a sequência das proteínas estruturais (VP0-VP3-VP1-2A), enquanto o segundo gene codifica a protease 3C. Nesse caso, a protease já estaria separada das proteínas precursoras do capsídeo viral, o que reduziria tempo no processo de formação das VLPs. Já na terceira estratégia (VP0+VP3-1), as proteínas que formam o capsídeo do HAV foram separadas em duas ORFs distintas. A primeira delas corresponde à sequência da VP0 (VP2-VP4), enquanto a segunda inclui sequências da VP1, a protease 2A de FMDV, VP3 e a 2A do HAV (importante para o sinal de montagem dos pentâmeros). Nesse caso, a protease utilizada é a do vírus FMDV, conhecida por clivar as sequências de proteínas estruturais virais. As estratégias e seus respectivos nomes, podem ser visualizados na Tabela 1.
Tabela 1. Estratégias para geração das VLPs do HAV. As três estratégias definidas para a
formação das VLPs do HAV foram denominadas 1- HAV-PTRUNC, 2- P1+3C, 3- VP0+VP3-1. A número 1 possui uma ORF que contém as proteínas estruturais VP4-VP3-VP2-VP1-2A, uma região não-codificante espaçadora (para simular espacialmente as regiões do genoma viral que foram deletadas) e a protease 3C. A segunda estratégia possui duas ORFs distintas, sendo a ORF1 composta pela região P1 viral (VP4-VP2-VP3-VP1-2A) e a ORF2 pela protease 3C. A terceira estratégia também possui duas ORFs, a primeira corresponde à VP0 (VP4-VP2) e a segunda contêm os genes das proteínas VP3 e VP1, separados pela protease 2A do vírus FMDV e com a 2A do vírus da hepatite A no final.
Fonte: O Autor (2017).
A estratégia HAV-PTRUNC foi idealizada e sua sequência otimizada utilizando o programa LETO 1.0 (Entelechon®) para expressão em células 293 humanas em um trabalho anterior (SOUSA, 2011). Já as estratégias 2 e 3 foram desenhadas no início deste trabalho e tiveram suas sequências de nucleotídeos otimizadas para expressão em células de insetos utilizando o mesmo programa que utiliza um algoritmo genético capaz de alterar sequências de nucleotídeos, sem, no entanto modificar os aminoácidos codificados por elas. O LETO é usado para alterar parâmetros como: diferenças de códons entre organismos, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo de GC, motivos repetitivos de DNA, sítios de restrição e de splicing. A otimização teve como objetivo minimizar diferenças entre os codon usages do HAV e da linhagem de células de insetos Sf9 e alterar outros parâmetros relevantes na expressão dos peptídeos, no intuito de expressar uma quantidade mais elevada das proteínas virais recombinantes nas células hospedeiras. Após otimização, as sequências foram enviadas para síntese comercial (Geneart®). Todas as construções foram idealizadas com base no mecanismo de formação do capsídeo do vírus da hepatite A (Figura 11).
Figura 11. Formação do capsídeo do vírus da hepatite A. O RNA do HAV é composto por três
regiões distintas: uma região não codificante à esquerda denominada 5’UTR (que contém o sítio IRES), um único quadro de leitura aberto (ORF) que possui os genes de todas as proteínas / enzimas virais e é traduzido como uma poliproteína e uma região não codificante à direita que contém uma cauda poli A. A ORF pode ser representada nas regiões que codificam as proteínas do capsídeo viral (roxo) e nas regiões responsáveis pela replicação do material genético do vírus (azul). Na poliproteína, ainda, existe uma protease (vermelha) que se autocliva e cliva as outras proteínas virais (com ajuda de proteases da célula hospedeira), para que cada uma possa exercer sua função na formação de partículas virais maduras. Para a formação do capsídeo viral, a protease 3C reconhece a região 2A e a cliva, separando-a das proteínas não-estruturais do vírus. Após as clivagens são separadas as proteínas VP4-VP2 (que formam o complexo denominado VP0), VP3 e VP1-2A. Posteriormente, tanto a 2A, quanto a VP4 são clivadas e o capsídeo maduro do HAV é formado com as proteínas VP2, VP3 e VP1.
Fonte: O Autor (2017).
4.2 CLONAGENS EM PLASMÍDEOS DE TRANSFERÊNCIA PARA
TRANSPOSIÇÃO SÍTIO-ESPECÍFICA
4.2.1 Clonagem estratégia 1- HAV-PTRUNC no vetor pFastBac1
A construção HAV-PTRUNC (estratégia 1) foi sintetizada com sítos para as enzimas de restrição NheI (região 5’) e KpnI (região 3’). O DNA otimizado clonado em plasmídeo comercial foi inicialmente obtido em larga escala a partir de transformação em cepas DH10B quimiocompetentes de Escherichia coli (eficiência de 4x107 células/µg), utilizando 50 µl de células e 100 ng de DNA plasmidial. A reação de transformação foi incubada 30 minutos no gelo e 5 minutos a 37 °C. As bactérias foram semeadas em meio Luria-Bertani (LB) sólido, contendo ampicilina (amp), em uma concentração final de 50 µg/ml. As placas foram incubadas a 37 °C por 18 horas e colônias isoladas foram inoculadas em 250 ml de meio LB amp (50 µg/ml) líquido, sendo submetidas a agitação de 160 rpm por 18 horas. As culturas
foram centrifugadas a 8.000 g e o DNA plasmidial foi extraído utilizando o kit QIAprep® Spin Midiprep (Qiagen®). Para a clonagem, 5 µg do DNA plasmidial e do vetor comercial pFastBac1 (InvitrogenTM) foram clivados utilizando 5 unidades de NheI e KpnI (New England BioLabs®), com o tampão 1.1 (1x) (New England BioLabs®), em uma reação com volume final de 50 µl, por 8 horas a 37 °C. A digestão dos fragmentos foi confirmada após fracionamento das amostras em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio e analisado através da observação em luz ultravioleta (UV) de um transluminador. Após a comprovação das clivagens nos sítios de interesse, todo conteúdo das reações foi fracionado e posteriormente excisado do gel, sendo purificado utilizando o kit GFX PCR DNA and Band Purification (GE Healthcare®). Os fragmentos purificados da contrução e do vetor foram quantificados utilizando o espectofotômetro NanodropTM. As ligações foram
realizadas com um volume final de 10 µl e continham 1 µl de T4 DNA Ligase Buffer 10x (New England Biolabs®), 1 µl de T4 DNA ligase (New England Biolabs®), DNAs do vetor e do inserto (µg:µg) em proporções de 1:1, 1:3, 1:5 e água Mili-Q (para completar o volume da reação). As amostras foram incubadas à 16º C por 18 horas e transformadas em células DH10B, quimiocompetentes, por 30 minutos no gelo e 5 minutos a 37 °C, sendo, posteriormente, plaqueadas em meio LB com ampicilina (100 µg/ml) e incubadas por 18 horas a 37º C. As colônias que cresceram nas placas tiveram seus DNAs plasmidiais expressos em pequena escala (5 ml) e extraídos pelo kit QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen®). A clonagem foi confirmada através da digestão em pequena escala (com volume final de 10 µl), utilizando as enzimas PstI e SacI (New England Biolabs®). A Figura 12 mostra a sequência utilizada nessa estratégia e o vetor comercial no qual ela foi clonada.
Figura 12. Estratégia 1 – Representação da construção HAV-PTRUNC clonada no vetor comercial pFastBac1. Nessa estratégia todas as proteínas responsáveis pela formação do capsídeo
viral (VP4-VP2-VP3-VP1-2A coloridas em roxo) foram acrescidas de um DNA espaçador (logo após o fim da 2A) e da protease 3C (vermelho), no intuito de simular o genoma do vírus da hepatite A. A sequência foi otimizada para expressão em células eucarióticas utilizando o programa Leto 1.0 (Entelechon®) e produzida comercialmente no trabalho de Sousa, 2011. Ela foi clonada no vetor
comercial pFastBac 1 (InvitrogenTM), que contém o promotor da poliedrina (PPH) e possui 4.8 kb.