O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Celular e Molecular – LBCM – do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto.
5.1 – Microrganismos
Para a realização do presente trabalho, foram utilizadas uma cepa de Saccharomyces cerevisiae LBCM1078, anteriormente isolada de dorna de fermentação de cachaça, e quatro cepas de Lactobacillus brevis LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720, isoladas a partir de ambiente produtivo cervejeiro (Campos, 2014), todas adicionadas à coleção do LBCM.
Todos os microrganismos foram mantidos a -80°C em seus meios de cultura apropriados, adicionados de 30% de glicerol. A levedura foi mantida em YPD2% e os lactobacilos em MRS.
Tabela 1: Microrganismos utilizados neste trabalho.
Cepas Espécie Origem
LBCM1078 Saccharomyces cerevisiae Dorna de fermentação de
cachaça
LBCM717 Lactobacillus brevis Ambiente cervejeiro
LBCM718 Lactobacillus brevis Ambiente cervejeiro
LBCM719 Lactobacillus brevis Ambiente cervejeiro
29 5.2 – Meios de cultivo
5.2.1 – Meio YPD2%
O meio YPD2% (Yeast Extract Peptone Dextrose 2%) é composto por extrato de levedura 1% (p/v), peptona 2% (p/v), glicose 2% (p/v) como fonte de carbono, e água destilada. Para meio sólido, foi utilizado ágar 2% (p/v).
Para realização das fermentações consorciadas em escala laboratorial, a glicose foi substituída por maltose como fonte de carbono, na mesma concentração (2% p/v).
5.2.2 – Meio MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)
O meio MRS (Acumedia) foi utilizado conforme recomendações do fabricante (5,5% p/v). Para meio sólido, foi utilizado ágar 2% (p/v).
5.2.3 – Extrato de malte
Foi utilizado o extrato de malte Brewferm® 8 EBC e, de acordo com o fabricante, a concentração de açúcares presentes em 1 Kg de extrato de malte corresponde à concentração encontrada em 1,6 Kg de malte em grão. O extrato de malte foi diluído a 13,4° Plato, autoclavado por 15 minutos e utilizado como meio para fermentações consorciadas entre BALs e levedura.
30 5.3 – Avaliação do crescimento em diferentes temperaturas
As bactérias do ácido láctico tiveram seu crescimento em 15°C e 20°C avaliado e comparado com o crescimento em 30°C, temperatura usada como controle.
As bactérias foram pré-cultivadas em tubos contendo 5 mL de meio MRS, sob agitação a 200 rpm (incubador rotatório New Brunswick Model G25), durante 24 horas, a 30°C. Uma alíquota de 500 µL da cultura padronizada a uma densidade óptica de 0,6 a 600nm foi transferida para frascos Erlenmeyer contendo 50 mL de meio MRS, incubados em 15°C, 20°C e 30°C, por 120 horas. Foram realizadas leituras de D.O.600nm
nos tempos 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas, ou seja, a cada tempo, alíquotas foram coletadas para leitura da absorbância em espectrofotômetro.
5.4 – Crescimento em extrato de malte
A fim de avaliar o metabolismo das bactérias do ácido láctico em presença de maiores concentrações de açúcares, foi realizada curva de crescimento das quatro cepas de Lactobacillus brevis utilizadas neste trabalho em 16% de extrato de malte.
As cepas LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720 foram cultivadas em tubos contendo 5 mL de meio MRS, sob agitação a 200 rpm (incubador rotatório New Brunswick Model G25), durante 24 horas a 30°C. Uma alíquota de 500 µL das culturas padronizadas a uma densidade óptica de 0,6 a 600 nm foi transferida para frascos Erlenmeyer contendo 50 mL de extrato de malte 16% (p/v), incubados a 30°C durante 70 horas. Neste período, foram coletadas alíquotas para realizar leitura de D.O.600nm,
31 5.5 – Fermentações consorciadas
A cepa de levedura LBCM1078 bem como as cepas de bactérias do ácido láctico LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720 foram avaliadas em fermentações consorciadas em escala laboratorial (50 mL), utilizando meio de cultura definido YP 2% maltose (p/v) ou extrato de malte 13,4° Plato, a 20°C.
A proporção entre leveduras e bactérias utilizadas foi de 1,0 x 107UFC/mL de leveduras e 1,0 x 104 UFC/mL de bactérias lácticas.
5.5.1 – Fermentações consorciadas em escala laboratorial em YP maltose
A levedura e as bactérias foram ativadas em 5 mL de meio YP glicose 2% e meio MRS, respectivamente, incubadas a 30°C, sob agitação durante 24 horas. A partir desse pré-cultivo, a cultura de levedura foi inoculada em 200 mL de meio YP glicose 2% e as culturas de bactérias lácticas foram inoculadas em 50 mL de meio MRS, incubadas a 30°C, sob agitação (200 rpm), durante 24 horas.
Foi calculado o volume a ser inoculado em cada tubo de fermentação através da medida da densidade óptica (D.O.) de cada cultivo. As células foram então lavadas com solução salina 0,85%, centrifugadas a 3000 g (micro-centrífuga Eppendorf 5415D) por 5 minutos e inoculadas nos tubos para a fermentação contendo 50 mL de YP maltose 2%.
Os tubos de fermentação foram incubados a 20°C, sem agitação, durante 13 dias. As fermentações foram feitas utilizando cada cepa de Lactobacillus brevis em consórcio com a cepa de levedura LBCM1078. Além disso, como controle, também foram realizadas fermentações individuais com cada microrganismo. Todas as fermentações foram realizadas em triplicata.
32 O desempenho fermentativo foi avaliado pesando-se os tubos diariamente e a perda de peso foi utilizada para estimar a produção de etanol, a partir da Fórmula 1, onde 92 corresponde à massa de duas moléculas de etanol e 88, à massa de duas moléculas de gás carbônico, geradas a partir de cada molécula de glicose durante a fermentação.
Fórmula 1: Produção estimada de etanol a partir da perda de peso.
( )
Ao final das fermentações, amostras do sobrenadante foram coletadas para a análise de etanol, ácido láctico, ácido acético e lactato de etila.
5.5.2 – Fermentações consorciadas em extrato de malte
O crescimento e padronização das células foram realizados conforme descrito no item 5.5.1, sendo o inóculo realizado em 50 mL de extrato de malte 16%.
Essas fermentações foram conduzidas entre a cepa de levedura LBCM1078 e cada uma das cepas de bactérias do ácido láctico LBCM717, LBCM718, LBCM719 e LBCM720.
Com a finalidade de definir o melhor momento durante a fermentação em que as BALs deveriam ser inoculadas, a fermentação em 16% de extrato de malte foi realizada de duas maneiras diferentes.
Primeiramente foi realizado o co-inóculo entre a cepa LBCM1078 e cada uma das cepas de Lactobacillus brevis, onde a levedura e a bactéria foram inoculadas simultaneamente. Os tubos de fermentação foram, então, incubados a 20°C, sem agitação, durante 5 dias. Ao longo desse período, a perda de peso, decorrente da
33 liberação de gás carbônico, foi acompanhada através de pesagens diárias. Ao final das fermentações, amostras do sobrenadante foram coletadas para a análise de etanol, ácido láctico, ácido acético e lactato de etila.
Em um segundo momento, as fermentações foram conduzidas a partir do inóculo dos microrganismos de maneira sequencial, onde a levedura LBCM1078 foi primeiramente inoculada e, ao final da fermentação alcoólica (4 dias após o inóculo das leveduras – momento definido a partir da estabilização da perda de peso dos tubos de fermentação), cada cepa de Lactobacillus brevis foi inoculda nos tubos de fermentação. Foi definido como fim da fermentação alcoólica o momento em que não houve variação maior que 0,1g na pesagem dos tubos. A fermentação láctica durou 2 dias, quando amostras do sobrenadante foram coletadas para a análise de lactato de etila.
5.6 – Produção das cervejas
As cervejas foram produzidas a partir do co-inóculo entre os microrganismos, em escala piloto, segundo as condições descritas na Tabela 2. Foi preparado um volume de 30 L de mosto e, posteriormente, aliquotado em três porções iguais, para inóculo dos microrganismos. Foram utilizados dois tipos de malte, na proporção de 59% de malte de trigo e 41% malte de cevada. Foi utilizado o lúpulo Spalter Select, com concentração de α-ácidos igual a 3,4%, tanto para amargor quanto para aroma. A concentração inicial de sólidos solúveis do mosto foi 12,5° Plato.
34 Tabela 2: Condições de produção das cervejas.
Etapa Condições Mosturação 53°C 30 minutos 63°C 30 minutos 68°C 2 horas 75°C 5 minutos 1ª lupulagem - 90° 95° - Fervura 45 minutos 2ª lupulagem 15 minutos Agitação 5 minutos Repouso 15 minutos Resfriamento 45 minutos Fermentação 20°C 10 dias Maturação 5°C 7 dias
Para todas as cervejas produzidas, a concentração de sólidos solúveis foi mensurada diariamente (curva de atenuação), ao longo da fermentação.
As cervejas produzidas foram analisadas por cromatografia gasosa para a quantificação de etanol, álcoois superiores, ésteres de acetato, ésteres de ácido graxo de cadeia média e lactato de etila. Também foi realizada a análise do pH e a classificação da coloração das cervejas produzidas.
Durante a fermentação, amostras das cervejas foram coletadas para a realização da contagem do número de células, realizada em placas de Petri contendo os meios YP glicose 2%, para contagem de leveduras, e o meio MRS, para contagem das BALs. Para contagem das leveduras, as placas de Petri foram incubadas em estufa na temperatura de 30°C, durante 48 horas. Já para contagem das BALs, as placas foram incubadas em estufa na temperatura de 37°C, durante 72 horas.
35 5.7 – Análises físico-químicas
5.7.1 – Análises das fermentações em escala laboratorial
5.7.1.1 – Lactato de etila
Para análise de lactato de etila presente nas amostras das fermentações (conforme descrito nos itens 5.5.1 e 5.5.2), as amostras foram coletadas e submetidas à extração com solvente orgânico de acordo com metodologia descrita por Carvalho (2011), com algumas modificações.
A) Extrações
Alíquotas de 25 mL foram coletadas ao final das fermentações, bem como da cerveja produzida. Após centrifugação a 2885 g por 10 minutos, 10 mL do sobrenadante foi coletado para extração do lactato de etila para análise cromatográfica.
Os 10 mL do sobrenadante foram transferidos para tubos de centrífuga de vidro, foram adicionados 2 gramas de NaCl e 2 mL de acetato de etila, e então, agitados em vortex por 2 minuto. As amostras foram centrifugadas a 1154 g por 15 minutos.
Para a análise do lactato de etila, 1 mL da fase orgânica foi coletado e analisado em cromatógrafo gasoso com detector de massas (CG-MS).
36 B) Análise cromatográfica
As dosagens de lactato de etila foram realizadas em um cromatógrafo Shimadzu CG-MS – QP2010 plus, equipado com um detector de massas quadrupolo, operando no modo de impacto eletrônico com 70 eV, escaneamento e monitoramento de íon seletivo (SIM). A tabela 3 mostra os íons monitorados neste trabalho.
Tabela 3: Íons monitorados (m/z) para a análise de lactato de etila no modo SIM
Janela Tempo de
aquisição (min.)
Modo de
aquisição Íon (m/z*) Composto
4,5 – 12,5 SCAN - -
12,5 – 14,0 SIM 45, 56, 75 Lactato de Etila
14,0 – 35,0 SCAN - -
*m/z: razão massa-carga
A coluna cromatográfica empregada foi uma coluna capilar EliteWax (30m x 0,25mm x 0,5µm, fase estacionária de polietilenoglicol). Injetor, detector e interface a 240°C e a seguinte programação de temperatura de forno foi aplicada: temperatura inicial de 35°C, elevada a 120°C numa taxa de 3°C/min., e então elevada até 240°C a 20°C/min. e mantida por 15 minutos.
O volume injetado foi de 1µL no modo splitless por 0,75 minutos, e então ativado o modo Split com taxa de 1:50 utilizando gás hélio como gás de arraste, com fluxo de 1,24mL/min.
A confirmação dos picos foi realizada por comparação do tempo de retenção e do espectro de massas obtido para padrão e amostras. Para análise quantitativa empregou-se o método de calibração externa.
37 5.7.1.2 – Análise por cromatografia líquida de alta eficiência
Para as análises de glicose, ácido láctico, ácido acético e etanol realizadas ao longo do trabalho, foram coletados 1 mL dos sobrenadantes e centrifugados a 8000 rpm por 10 minutos. Após a centrifugação, os sobrenadantes foram filtrados em membrana com poro de 0,22 µm de diâmetro.
As dosagens foram realizadas em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Shimadzu LC – 20AT, utilizando uma coluna REZEX ROAO – ácido orgânico H+, utilizando como fase móvel H2SO4 (5 Mm), temperatura de operação
de 45°C e fluxo de 0,7 mL/min.
5.7.2 – Análises cromatográficas das cervejas
5.7.2.1 – Lactato de etila
As extrações do éster lactato de etila nas amostras das cervejas produzidas foi realizado conforme descrito no item 5.7.1.1.
As dosagens de lactato de etila nas cervejas produzidas foram realizadas em um cromatógrafo Shimadzu Tracera CG – 2010 Plus, equipado com um detector de ionização por plasma BID – 2010 Plus.
A coluna cromatográfica empregada foi uma coluna capilar EliteWax (30m x 0,25mm x 0,5µm, fase estacionária de polietilenoglicol). Injetor, detector e interface a 240°C e a seguinte programação de temperatura de forno foi aplicada: temperatura inicial de 35°C, elevada a 120°C numa taxa de 3°C/min., e então elevada até 240°C a 20°C/min. e mantida por 15 minutos.
38 A confirmação dos picos foi realizada por comparação do tempo de retenção e do espectro de massas obtido para padrão e amostras. Para análise quantitativa empregou-se o método de calibração externa.
5.7.2.2 – Análise de álcoois superiores, ésteres e acetaldeído
As determinações de álcoois superiores (isobutanol e álcool isoamílico), ésteres (acetato de etila, acetato de isoamila, acetato de isobutila, butirato de etila, hexanoato de etila, octanoato de etila) e acetaldeído foram realizadas por cromatografia gasosa, em cromatógrafo a gás CP3380 da Varian e detectados por ionização em chama (DIC).
Foi utilizada a coluna cromatográfica DB-WAX (60m x 0,25mm x 0,25µm, fase estacionária de polietilenoglicol). As temperaturas de injetor e detector permaneceram em 225°C e 280°C, respectivamente, e as temperaturas do forno seguiram a seguinte programação: temperatura inicial de 50°C, mantida durante 5 minutos. Em seguida, elevada a 100°C a uma taxa de 5°C por minuto, mantida durante 1 minuto e, posteriormente, elevada a 250°C, a uma taxa de 30°C por minuto, mantida por 3 minutos, totalizando 22 minutos de corrida.
As amostras foram extraídas em vials vedados de 15 mL, contendo 5 mL de cerveja, onde foram adicionados 20 µL de PI (padrão interno – n-pentanol 2,0% (v/v)). Os vials foram aquecidos em banho maria à 60ºC por 30 min. Após aquecimento, o volume de 5 mL da fase vapor foi recolhido em seringa gastight de 25 mL a 60ºC e imediatamente injetado no cromatógrafo gasoso nas condições citadas. As concentrações de cada substância foram obtidas das relações entre as áreas dos picos observados para as amostras e as áreas dos picos do padrão interno utilizado (n- pentanol). Os valores apresentados representam a média de três determinações e as análises estatísticas foram realizadas conforme descrito no item 4.8. As concentrações foram expressas em miligramas por litro (mg/L).
39 5.7.2.3 – Análise de etanol
As análises de etanol foram realizadas por cromatografia gasosa, em cromatógrafo a gás CP3380 da Varian e detectados por ionização em chama (DIC).
Foi utilizada a coluna cromatográfica DB-WAX (60m x 0,25mm x 0,25µm, fase estacionária de polietilenoglicol). As temperaturas de injetor e detector permaneceram em 225°C e 280°C, respectivamente, e as temperaturas do forno seguiram a seguinte programação: temperatura inicial de 80°C, mantida durante 1 minuto. Em seguida, elevada a 100°C a uma taxa de 5°C por minuto, mantida durante 1 minuto e, posteriormente, elevada a 250°C, a uma taxa de 30°C por minuto, permanecendo a essa temperatura por 1 minuto, totalizando 13,33 minutos de corrida.
As amostras foram extraídas em vials vedados de 15 mL, contendo 5 mL de cerveja diluída 250 vezes em água, onde foram adicionados 20 µL de PI (padrão interno – n-pentanol 2,0% (v/v)). Os vials foram aquecidos em banho maria à 60ºC por 30 min. Após aquecimento, o volume de 5 mL da fase vapor foi recolhido em seringa gastight de 25 mL a 60ºC e imediatamente injetado no cromatógrafo gasoso nas condições citadas. A concentração foi determinada pela relação entre a área do pico correspondente ao etanol e a área do pico do padrão interno utilizado (n-pentanol). Os valores apresentados representam a média de três determinações e as análises estatísticas foram realizadas conforme descrito no item 4.8. As concentrações foram expressas em porcentagem (v/v).
5.7.2.4 – Classificação de cor pelo Standard Reference Method (SRM) e dosagem de pH
A metodologia utilizada para classificação de cervejas quanto à coloração, recomendada pela BJCP (Beer Judge Certification Program) é o SRM (Standard
40 Reference Method). Para tanto, as amostras de cervejas foram centrifugadas a 16000 g (micro-centrífuga Eppendorf 5415D), por 3 minutos e, em seguida, o sobrenadante foi coletado e procedida a medida da D.O.430nm. Os valores obtidos de cada amostra foram
multiplicadas por 10 (Morado, 2009). Os valores apresentados representam a média de 3 determinações e as análises estatísticas foram realizadas conforme descrito no item 4.8. O pH das cervejas foi determinado em potenciômetro Ankersmt, ORION, modelo 720A.
5.8 – Análise estatística
Os valores determinados de etanol, ácido láctico, ácido acético, álcoois superiores, ésteres de acetato, ésteres de ácidos graxos de cadeia média, lactato de etila, SRM e pH das cervejas produzidas foram analisados utilizando o softwere Prisma 5, aplicando o Teste de Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os valores relacionados ao crescimento das BALs e ao declínio do pH durante o crescimento em extrato de malte foram obtidos a partir da média simples entre as amostras e desvio padrão.
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