Material e Métodos

2.1.Obtenção dos óleos

O óleo bruto de buriti foi adquirido no comércio popular da cidade de Picos – PI, Brasil. As amostras de óleo foram extraídas de forma artesanal a partir de frutos maduros mediante o cozimento em água por 20 minutos na temperatura de ± 60 °C, separando-se posteriormente a fração oleosa da aquosa. Para todos os experimentos foram utilizados 3 L de óleo bruto que foi refinado de acordo com as etapas de degomagem, neutralização, lavagem e secagem segundo a metodologia adaptada de Moretto e Fett (1989). Utilizou-se óleo de soja de uma mesma marca comercial, para ser adicionado na dieta controle, sendo adquirido em supermercado local.

2.2.Tratamento dos animais e dietas

Foram utilizados 20 ratos machos da linhagem Wistar, com idade ± 90 dias e peso inicial de ± 335 g que foram mantidos em gaiolas individuais com água e ração ad libitum, temperatura 22 ± 1 ° C, umidade relativa entre 50 e 55 % e ciclo claro/escuro de 12 h. Avaliou-se o status das enzimas antioxidantes a partir da indução ao estresse fisiológico que

foi provocado por gavagem (Õkva et al, 2006) diária durante 17 dias, com quantidade de 2 mL de solução salina para os grupos controle ou 2 mL de sulfato de ferro II para os grupos experimentais (Mendes et al., 2009).

Os teores de macro e micronutrientes das dietas foram calculados e equilibrados seguindo as recomendações do American Institute of Nutrition (AIN) (Reeves et al, 1993). Os animais foram distribuídos em quatro grupos: grupo controle com gavagem com solução salina e dieta AIN 93M com óleo de soja (CS; n = 5), grupo controle com gavagem diária com solução salina e dieta AIN 93M contendo óleo de buriti (CB; n = 5), grupo experimental com gavagem com sulfato de ferro II e dieta AIN 93M contendo óleo de soja (FS; n = 5) e grupo experimental com gavagem com sulfato de ferro II e dieta AIN 93M contendo óleo de buriti (FB; n = 5). Todo o protocolo experimental foi procedido mediante a aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa Animal – CEPA – UFPE sob o número 23076.001000/2010-29

As dietas destinadas aos grupos CS, FS, CB e FB (Tabela 1) foram preparadas semanalmente e oferecidas diariamente em quantidade suficiente para garantir o consumo ad libitum, durante os 17 dias de experimento. O peso e o consumo da dieta foram avaliados a cada dois dias durante os 17 dias de ensaio.

Tabela 1 – Composição centesimal das dietas oferecidas aos grupos controles e experimentais

Ingredientes Quantidades (g/100g)

CS e FS CB e FB Energia (Kcal) Energia(Kcal)

Amido de milho 61.9 247.60 247.60

Caseína 14.0 48.00 48.00

Sacarose 10.0 40.00 40.00

Óleo de soja ou de buriti 4.0 36.0 36.0

Celulose 5.0 - - Mix minerais 3.5 - - Mix vitamínico 1.0 - - D-L metionina 0.3 - - Bitartarato de colina 0.3 - - Total 100.00 341.80 341.80

Abreviaturas: grupos controle contendo óleo de soja e gavagem com solução salina (CS) e óleo de buriti e gavagem com solução salina (CB) e experimentais contendo óleo de soja e gavagem com sulfato ferroso (FS) e óleo de buriti e gavagem com sulfato ferroso (FB) de acordo com as recomendações da AIN – 93M.

2.3.Determinação de vitamina A nas dietas e ingestão de β caroteno pelos ratos

O método para a determinação de vitamina A na dieta foi adaptado de Berbel (2007). Foram pesadas 5 g de amostra em tubo de ensaio e adicionou-se 10 mL de etanol com 0.25% de BHT, 5 mL de água destilada e 0.5g de cloreto de sódio. Em seguida foram adicionados

10 mL de hexano a cada amostra. Após, agitação, o sistema reacional foi sonicado por 3 min. As amostras foram centrifugadas a 1000 rpm por 3 min para a retirada do extrato hexânico que foi acondicionado em frascos âmbar. Os procedimentos de lavagem com hexano e retirada do extrato citados foram realizados cinco vezes. A fração hexânica foi evaporada com nitrogênio e resuspensa em 3 mL de metanol padrão HPLC. Esta amostra foi filtrada em membrana Minlipore Fluoropore 0.5 µm e injetada no HPLC (Varian mod. 2699), acoplado a um detector de arranjo de diodo (DAD), sendo a coluna cromatográfica C18 (Chrompack- Varian, Inerstisil – 150 x 4,6mm 5ODS-2). A análise foi executada sob as seguintes condições cromatográficas: fase móvel: metanol:água (98:2), fluxo de 1 mL min-1 com detecção em 325 nm. A identificação foi efetuada por comparação aos tempos de retenção de substâncias padrão sob as mesmas condições experimentais. A quantificação foi realizada pelo método de padronização externa.

A ingestão de vitamina A sob forma de β caroteno que é o principal carotenóide encontrado no óleo de buriti, foi calculada a partir da quantidade de β caroteno determinada nos três tipos de dieta em função da quantidade de ração consumida por cada grupo de animais.

2.4.Parâmetros murinométricos

Os parâmetros murinométricos foram realizados com os animais anestesiados, antes da eutanásia, conforme metodologia descrita por Novelli et al (2007). Utilizando–se fita métrica aferiu-se: a circunferência abdominal (CA), imediatamente anterior a pata traseira e a circunferência torácica (CT), imediatamente posterior a pata dianteira, além do comprimento corporal (CC) que é medido do nariz até a base da cauda e do peso corporal. O Índice de Massa Corporal (IMC) foi calculado dividindo-se o peso corporal (g) pelo comprimento ao quadrado (cm2) e o Índice de Lee (IL) foi calculado pela raiz cúbica do peso corporal (g) dividido pelo comprimento (cm).

2.5.Parâmetros bioquímicos

Após o período experimental de 17 dias e um jejum de 12 h, os animais foram anestesiados, o sangue foi coletado por punção cardíaca direta para retirada de 4 ml de cada animal. O soro foi obtido após centrifugação (3000 rpm/10 min) e mantido à temperatura de 25 oC para a realização das dosagens de colesterol (enzimático), HDL-C (Polietilenoglicol- PEG), LDL-C (Polietilenoglicol-PEG), VLDL-C (Polietilenoglicol-PEG) e triglicerídeos

(enzimático) (Kit Dolles). O conteúdo de hemoglobina e hematócrito foram determinados em analisador automatizado (ABX micro 60, Tokyo, Japão). Após a coleta de sangue, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.

2.6.Atividade das enzimas antioxidantes

Após 24 h do último tratamento, os animais foram eutanasiados e laparotomizados. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca e centrifugadas (825g / 4 º C/10 min) para obter soro e hemácias, utilizadas para determinar as enzimas antioxidantes, superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), além do hemograma. O fígado de cada rato foi removido e lavado para determinar a atividade antioxidante em homogenato deste tecido. As determinações foram realizadas em triplicata.

O hemolisado foi preparado, separando-se os eritrócitos do plasma, sendo lavado três vezes com tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,4) e centrifugado a 825g / 4 º C/10min. Para 0.2 mL do sedimento foi adicionado 1.8 mL de 0.4% β-mercaptoetanol (v / v) e em seguida as amostras foram congeladas a -20 º C por 20 min. O hemolisado foi centrifugado a 8274g / 4 º C/40min e o sobrenadante foi utilizado para a determinação da atividade das enzimas antioxidantes. O homogenato de fígado foi preparado a partir da homogeneização do tecido hepático em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) em um homogeneizador Potter-Elvehjem a 10% (w / v) de homogenato de fígado. Após centrifugação (8274g / 4 ºC/4min), o sobrenadante foi utilizado para avaliação das enzimas antioxidantes.

A atividade antioxidante da SOD e da GPx foram determinadas no sangue e no fígado dos animais. A atividade da SOD (E.C. 1.15. 1.1) foi determinada utilizando Kit RANSOD (Randox Laboratories Crumlin, UK), sendo a absorbância medida a 505 nm, enquanto a atividade antioxidante da GPx (E.C. 1.11.1.9) foi determinada utilizando Kit RANSEL kit (Randox Laboratories) de acordo com metodologia descrita por Paglia e Valentine (1967). A leitura espectrofotométrica foi efetuada a 340 nm em espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS modelo 1650-PC (Tokyo, Japão). As atividades de SOD e de GPx foram expressas em IU/mg de hemoglobina para o sangue ou IU/mg de proteína para o fígado.

2.7.Análise Estatistica

Todos os valores foram expressos como média e desvio padrão, calculados por análise estatística de variância (ANOVA) e pós-teste de Tukey-Kramer, utilizando o Graph Pad Prism Software versão 5.0, considerando a significância estatística de p < 0,05.