MATERIAL E MÉTODOS

Animais

O experimento foi conduzido de Agosto a Março de 2013 (Botucatu, SP, Brasil, Latitude 22° 53’ 09” e Longitude 48° 26’ 4”) de acordo com a regulamentação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, com aprovação pela Comissão de Ética no uso de animais, protocolo número 139/2012. Foram utilizados 30 ciclos estrais de 24 éguas mestiças com idade entre cinco e 15 anos, peso entre 250-500 kg. O escore corporal das éguas permaneceu alto durante todo o experimento (nota ≥ 7, HENNEKE et al, 1983). Os animais foram alimentados com feno de Coast-Cross (Cynodon dactylon), ração, sal mineral e água ad libitum. As éguas foram mantidas em bom estado de saúde durante o experimento.

Éguas com ausência de anormalidades uterinas e ovarianas avaliadas utilizando US modo-B foram utilizadas. Éguas que desenvolveram folículos hemorrágicos anovulatórios, codominância seguida de ovulações duplas ou que não ovularam em até 48 horas após o tratamento com hormônio indutor de ovulação não foram utilizadas para a análise estatística.

Grupos Experimentais

Éguas foram acompanhadas a cada 24 horas com exame ultrassonográfico modo-B até ser detectado um folículo com diâmetro ≥35mm (H0) associado a edema uterino de 3 a 4 (GINTHER, 1995). Os 30 ciclos estrais foram distribuídos aleatoriamente em grupo GnRH, hCG e controle (n=10 ciclos/grupo).

Foi administrada 1,5 mg de deslorelina por via intramuscular, 2.500 UI de hCG (Vetecor, Laboratório Calier, São Paulo, Brasil) por via intravenosa e 2 mL de solução

salina (NaCl 0,9%) por via intravenosa nos grupos GnRH, hCG e controle, respectivamente. Os tratamentos foram administrados imediatamente após a H0 em dose única. Os parâmetros dos grupos GnRH, hCG e controle foram avaliados de hora em hora entre os intervalos H0-H12, os mesmos parâmetros foram avaliados a cada seis horas entre H18 até H30. As éguas dos grupos GnRH e hCG foram acompanhadas de hora em hora a partir da H30 até a ovulação e os dados das últimas seis horas foram utilizados.

Éguas do grupo controle foram examinadas, após a H30, utilizando US modo-B a cada quatro horas até a detecção de características indicativas de proximidade da ovulação, como presença de pontos hiperecóicos no fluido folicular, serrilhamento da camada da granulosa, presença de ápice folicular e perda do formato esférico (Revisado por GASTAL; GASTAL, 2011). A partir do aparecimento de uma ou mais características a US Doppler foi realizada de hora em hora até a detecção da ovulação. Os dados das últimas seis horas foram utilizados.

Figura 1: Diagrama representativo dos momentos de coleta de dados nos Grupos hCG, GnRH (A) e controle (B). H0 indica o momento imediatamente antes da realização do tratamento. OV indica o momento da detecção da ovulação.

Exame Ultrassonográfico Doppler

A perfusão sanguínea do folículo pré-ovulatório foi determinada utilizando a US Doppler função power-flow com um equipamento ultrassonográfico Doppler (SONOACE PICO, Medison do Brasil Ltda) equipado com transdutor multi-frequencial

A

(5 a 9 Mhz) linear endocavitário de banda larga (LV5-9CDn, 60mm). As configurações do aparelho foram mantidas constantes durante todo o experimento.

A avaliação subjetiva da PVF foi realizada através do somatório dos pontos coloridos Doppler detectados na parede folicular durante exame contínuo de um minuto utilizando o maior diâmetro folicular, determinando uma nota de 0 a 100% (GASTAL et al., 2006). Outras pesquisas realizadas em éguas (SILVA et al., 2006), vacas (SIDDIQUI; GINTHER, 2014) e mulheres (RAGNI et al., 2007) também utilizaram avaliação subjetiva de PV folicular.

Todos os exames ultrassonográficos foram gravados em um computador portátil equipado com placa de captura de vídeo (Pinnacle Studio 9). Posteriormente, os vídeos foram avaliados e classificados de acordo com o percentual de vascularização (Figura 2).

Figura 2: Imagem ultrassonográfica Doppler função power-flow de folículo pré-ovulatório de égua. Avaliação subjetiva da perfusão vascular folicular foi realizada levando em consideração o percentual (notas entre 0 e 100%) de extensão de parede folicular com pontos coloridos Doppler.

Concentração plasmática de LH

Para caracterização do perfil plasmático de LH, amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados por punção da veia jugular juntamente com todos os exames ultrassonográficos Doppler. As amostras foram centrifugadas (1500g/10 min) para separação do plasma, e armazenadas a –20ºC em criotubos até o momento do ensaio.

A concentração de LH foi analisada por meio de Radioimunoensaio (RIA) utilizando duplo anticorpo, gerado em coelhos contra gonadotrofina coriônica equina e

LH ovino radioiodo, previamente validado (THOMPSON et al., 1983). O coeficiente de variação intra- e interensaio foram 3,2% e 7,0%, respectivamente e a sensibilidade foi 0,4 ng/mL.

Análise estatística

Inicialmente, a distribuição das varáveis foi analisada e estatísticas descritivas foram produzidas para construir curvas de variação percentual. Para visualização da normalidade de distribuição dos dados, a avaliação das variáveis respostas foi realizada pelo teste de Shapiro-Wilk. Somente os valores para concentração de LH não seguiram distribuição normal e foram transformados para escala log para análise.

Análise de Variância (PROC GLM, SAS Institute, 2011) foi utilizada para comparar o tempo médio (horas) de ovulação entre os grupos. Modelos de medidas repetidas (PROC MIXED, SAS Institute, 2011) foram usados para comparar a vascularização (%) e concentração de LH (ng/mL), entre os tratamentos e momentos.

Um termo de interação entre tratamento e momento foi incluído nos modelos para testar a hipótese de que a diferença entre tratamentos foi dependente do momento analisado. Uma estrutura de covariância auto-regressiva foi usada para modelar a correlação entre as medidas repetidas dentro da mesma égua. O teste de Tukey foi usado para ajustar os valores-P resultantes de comparações múltiplas da PVF. O nível de significância estatística foi definido como P ≤ 0,05 e a tendência estatística entre 0,1 e 0,05. Dados são apresentados como média±E.P.M.

Um modelo de regressão linear (PROC REG, SAS Institute, 2011) foi utilizado para avaliar a concordância das notas de vascularização folicular entre os dois observadores. Houve alta correlação (r = 0,72; P < 0,0001) entre as notas dos avaliadores entre os momentos e a média entre os dois avaliadores foi utilizada. Foi realizada uma correlação de Pearson para avaliar a correlação entre a vascularização folicular e as concentrações de LH entre os momentos e grupos.

RESULTADOS

O intervalo entre o momento em que foi realizado o tratamento (H0) e o momento da ovulação foi mais longo (P < 0,0001) no grupo controle (80,00±3,38 horas) quando comparado aos grupos GnRH e hCG (40,06±1,05 e 37,70±0,47, respectivamente).

Efeito de grupo (P < 0,05) foi detectado para perfusão vascular folicular (PVF). Animais do grupo GnRH apresentaram maior PVF média (40,43±6,38%) quando comparado aos grupos hCG e controle (35,46±3,90 e 30,03±4,38%, respectivamente) desde H0 até o momento da ovulação. Não foi encontrado efeito de momento e efeito de momento dentro dos grupos (P > 0,05) (Figura 3).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10 20 30 40 50 60 18 24 30 a b b G: p< 0,031 Horas pós-tratamento P e rf usão V a sc ul ar F o lic u la r ( % ) -6 -5 -4 -3 -2 -1 10 20 30 40 50 60 OV b b a GnRH hCG Controle Horas pós-tratamento

Figura 3. Média±E.P.M para perfusão vascular da parede folicular (%) de éguas tratadas com 1,5 mg de deslorelina, 2.5000 UI hCG ou 2 mL NaCL 0,9% na presença de folículo ≥35mm associado a edema uterino. Efeito de grupo (G) é mostrado; grupos com letras minúsculas diferentes são diferentes. H0=momento imediatamente anterior ao tratamento. Seta indica momento do tratamento. Seta indica momento do tratamento. OV=momento em que ocorreu a ovulação.

A concentração média de LH entre H1 e H18 foi maior (P < 0,05) no grupo GnRH (11,60±2,36 ng/mL) do que nos grupos hCG e controle (4,09±0,83 e 5,82±1,35 ng/mL). Em éguas do grupo GnRH, um aumento (P < 0,001) na concentração plasmática de LH foi detectado entre a H0 e H1, atingindo valor máximo na H7 (13,92±2,61ng/mL). Houve uma diminuição numérica (P > 0,005) a partir da H10, e uma diminuição (P = 0,008) na concentração de LH foi observada a partir da H18.

Nos grupos controle e hCG a concentração plasmática de LH foi constante durante as primeiras 12 horas pós-tratamento. Um aumento na concentração de LH (P <0,001) foi detectado entre H18 e H30 no grupo hCG. Durante as últimas seis horas anteriores à ovulação (H -6 à H -1) a concentração de LH foi mais alta (P < 0,001) do que a encontrada na hora anterior ao tratamento (H0) no grupo GnRH e hCG.

As concentrações plasmáticos de LH foram semelhantes entre os grupos GnRH e hCG em todos os momentos, exceto entre a H5 e H12. O perfil de LH foi semelhante entre os grupos GnRH e controle exceto entre H7 e H9. O grupo controle exibiu concentrações de LH semelhantes ao grupo hCG durante todo o experimento (Figura 4).

A correlação entre a PV da parede folicular e as concentrações plasmáticas de LH foi baixa nos grupos GnRH, hCG e controle (r = +0,29; +0,29, -0,23; P ˂ 0,0001).

Figura 4. Média±E.P.M para concentração plasmáticas de LH (ng/mL) de éguas tratadas com 1,5 mg de deslorelina, 2.5000 UI hCG ou 2 mL NaCL 0,9% na presença de folículo ≥35mm associado a edema uterino. * indica diferença entre horas dentro do grupo GnRH, # indica diferença entre o grupo GnRH e hCG para cada hora, ° indica diferença entre grupo GnRH e controle para cada momento. H0=momento imediatamente anterior ao tratamento. Seta indica momento do tratamento. OV=momento em que ocorreu a ovulação.

DISCUSSÃO

Éguas dos grupos GnRH e hCG ovularam em 40,06±1,05 e 37,70±0,47 horas, respectivamente. Semelhante ao que foi relatado na literatura para éguas induzidas com deslorelina 41,4±9,4 e hCG 36,0±2,1 horas (FERRIS et al., 2011; GASTAL et al., 2006). As éguas do grupo controle apresentaram um intervalo maior entre o início do acompanhamento ultrassonográfico até a ovulação, 80,00±3,38 horas, como relatado: 78,4±6,3 horas (GASTAL et al., 2006) e 81.2±6.1 horas (GINTHER et al., 2009).

Em uma pesquisa a PVF inicial de 65% na H0 apresentou aumento progressivo de até 90% na H36 após tratamento com hCG ou NaCl 0,9%, e diminuição brusca até 40% de PVF na hora imediatamente anterior à ovulação (GASTAL et al., 2006). Ao contrário desta variação da PVF entre momentos não houve variação da PVF após tratamento com deslorelina, hCG ou NaCl 0,9% entre os momentos avaliados. Esta diferença pode ser devido aos menores valores e decorrente menor variação da PVF encontrada no presente estudo, com valor de aproximadamente 30% na H0 e de 20% a 40% na hora imediatamente anterior à ovulação.

Efeito de grupo foi detectado para PVF, sendo maior nas éguas do grupo GnRH. Quando indução com hCG ou análogo de GnRH buserelina foi comparada em vacas a média da PVF entre a hora 0 e hora 24 foi maior nas vacas tratadas com hCG do que nas

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 5 10 15 20 18 24 30 * * # # #° #° #° # # # * Horas pós-tratamento LH ( ng/ m L) -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 5 10 15 20 OV GnRH hCG Controle Horas

tratadas com GnRH (ASLAN et al., 2011). Esta discrepância pode ser decorrente da maior potência da deslorelina quando comparada com a buserelina (CONN; CROWLEY, 1991), o que pode ter ocasionado maior PVF nas éguas induzidas com este análogo de GnRH mais potente.

A PVF do grupo hCG não diferiu do grupo controle durante as horas após tratamento com hCG até a ovulação, assim como já tinha sido reportado na literatura (GASTAL et al., 2006). A concentração média de LH entre H1 e H18 foi maior (P < 0,05) no grupo GnRH do que nos grupos hCG e controle. Similarmente, a concentração plasmática de LH na circulação periférica das éguas tratadas com GnRH era de 3 a 4 vezes maior do que de éguas do grupo controle (VELEZ et al., 2012). Estas observações são decorrentes da diferente forma como esses indutores da ovulação agem. A hCG estimula maturação e ovulação em folículos pré-ovulatórios durante o estro por ligação com receptores de LH foliculares, mimetizando a ação do LH endógeno ao produzir um aumento pré-ovulatório exógeno de LH (ADAMS et al., 1986). A deslorelina estimula a liberação endógena de LH e FSH pela parte anterior da hipófise. Portanto, as concentrações plasmáticas de LH endógenas vão aumentar rapidamente quando se utiliza deslorelina, pois esta age sobre o hipotálamo. Quando se utiliza hCG as concentrações plasmáticas de LH endógeno vão permanecer constantes inicialmente, pois esta vai agir como um LH exógeno.

Como esperado, a concentração de LH em éguas controle não aumentou logo após o tratamento, já que concentrações mais altas de LH só vão ocorrer um dia após a ovulação em éguas (FREEDMAN et al., 1979; MUMFORD et al., 1995; JOHNSON et al., 2000; GINTHER et al., 2006).

Nas éguas do grupo GnRH um aumento na concentração plasmática de LH foi detectado após uma hora (H1) atingindo valor máximo na H7. Uso subcutâneo de deslorelina levou a um aumento de LH antes da ovulação entre 12 a 24 horas após tratamento (MUMFORD et al., 1995). Quando deslorelina injetável foi utilizada nove dias após a ovulação de éguas, a concentração de LH atingiu valor máximo quatro horas após tratamento e permaneceu elevada até 12 horas após tratamento, seguido de uma diminuição (KINO et al., 2014). Estes achados corroboram com a existência de um estímulo da deslorelina sobre o LH antes da ovulação, essencial para a ocorrência da ovulação em um menor intervalo de tempo (MUMFORD et al., 1995).

O RIA utilizado não possui reação cruzada com LH exógeno, desta forma as concentrações de LH detectadas permaneceram constantes durante as primeiras 12 horas

no grupo hCG. Um subsequente aumento na concentração de LH foi detectado entre a H18 e H30. Em éguas tratadas com hCG o nível de LH, avaliado com ensaio que não detecta hCG, permaneceu constante até a hora 24 após tratamento quando houve um aumento que continuou até a hora 72 (GINTHER et al., 2009). Este aumento é decorrente da produção endógena de LH no momento em que o folículo atinge maturidade, após a ação inicial do hCG como LH exógeno (EVANS et al., 2007).

Durante as últimas seis horas anteriores à ovulação (H -6 à H -1) a concentração de LH foi mais alta do que a encontrada na hora anterior ao tratamento (H0) no grupo GnRH e hCG (Figura 1). No grupo controle, a concentração de LH foi mais alta (P < 0,001) na H -1 quando comparada com a H0. Éguas que não foram tratadas com indutores de ovulação não tiveram a maturação de seus folículos adiantada, portanto logo antes da ovulação as concentrações endógenas de LH estão mais altas já que é esperado um aumento de LH próximo à ovulação (FREEDMAN et al., 1979; MUMFORD et al., 1995; JOHNSON et al., 2000; GINTHER et al., 2006).

Não foi observada uma correlação entre a variação da PVF e as concentrações plasmáticas de LH. Outros estudos apontam para ausência de correlação entre hormônios e PVF. Como o fato de folículos de éguas velhas (>20 anos) tratadas com eLH apresentarem PVF maior do que éguas jovens (entre 4 e 9 anos). Evidência de que não existe uma relação direta entre concentrações de LH e PVF (ALTERMATT et al., 2012), já que éguas velhas possuem menores concentrações de LH quando comparadas com éguas jovens (GINTHER et al., 2008). Similarmente, em vacas tratadas com GnRH, houve um aumento da PVF oito horas antes da ovulação o não foi acompanhado de variação nas concentrações plasmáticas de LH (SIDDIQUI et al., 2010).

Embora alguns estudos apontem para relações entre gonadotrofinas e PVF estas não são suficientes para esclarecer alterações na PVF de folículos pré-ovulatórios. Hormônios, fatores de crescimento e substâncias vasoativas parecem estar inter- relacionados com os mecanismos que levam a alterações na PVF (ACOSTA et al., 2004; ACOSTA; MIYAMOTO, 2004; WATSON; AL-ZI’ABI, 2002; GASTAL et al., 2006; SIDDIQUI et al., 2010). VEGF, fator de crescimento que regula a angiogênese fisiológica do aparelho reprodutivo, não foi expressa em folículo que sofreram atresia em mulheres (FERRARA; DAVIS-SMYTH, 1997; SUZUKI et al., 1998). Em contrapartida, houve upregulation das isoformas de VEGF em folículos coletados de vacas imediatamente após o pico de LH decorrente de aplicação de GnRH. Após ovulação a VEGF continuou a sofrer upregualtion, indicando que este fator de

crescimento possui um importante papel na ruptura do folículo dominante (BERISHA et al., 2008). Fluido folicular de folículos anovulatórios com 30 mm de diâmetro apresentou menores concentrações de IGF-1, o qual atua no desenvolvimento folicular e VEGF. Estes achados servem para elucidar diferenças de PVF durante as fases da estação reprodutiva, sendo o folículo pré-ovulatório mais irrigado devido a maior número de vasos, vasos de maior tamanho ou vasos mais tortuosos (ACOSTA et al., 2004a). São necessárias mais pesquisas para elucidar o mecanismo de variação de PVF e concentrações plasmática de LH em éguas tratadas com deslorelina, hCG ou NaCl 0,9%.

CONCLUSÃO

A US Doppler não parece ser uma ferramenta capaz de predizer com acurácia a capacidade ovulatória de um folículo e o momento da ovulação. Concentrações plasmáticas de LH não são responsáveis pela variação de PVF em éguas sendo necessárias mais pesquisas que apontem quais mecanismos estão envolvidos com alterações da PVF.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer o auxílio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP) e ao Dr. Thompson e a School of Animal Sciences - Louisiana State University Agricultural Center pelo RIA de LH.

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