1.3.1- Elaboração do sólido obtido durante a remoção do solvente do extrato hexânico do tronco de M. salicifolia
Durante a remoção do hexano para se obter EHT, observou-se a precipitação de um sólido branco (0,47 g), denominado SEHT, que foi separado por filtração a pressão reduzida. O sólido apresentou teste de Liebermann-Burchard positivo, indicando a presença de triterpenos pentacíclicos. Este foi submetido à separação cromatográfica, utilizando-se 20,0 g se sílica-gel. Foram coletadas 18 frações de aproximadamente 10 mL cada, utilizando-se como eluente clorofórmio, acetato de etila e depois metanol, puros ou em misturas em ordem crescente de polaridade. Por análise comparativa das frações coletadas foi possível, através de cromatografia em camada delgada de sílica (CCDS) agrupar somente as frações 12 a 16 (SEHT12) e as frações 17 e 18 (SEHT17). Entretanto, SEHT12 e SEHT17 apresentaram massa desprezível e não foram estudadas. As demais frações foram analisadas separadamente. A fração 3 apresentou-se como um sólido branco que, após análise por RMN, foi identificado como friedelina (MS1; 13,0 mg). Na fração 4 também foi observada a presença de friedelina, porém com impurezas.
A fração 7 ( 293,0 mg) foi recromatografada em coluna de sílica-gel 60 (13,0 g), tendo clorofórmio como eluente. Foram coletadas 28 frações de 5,0 mL cada, obtendo-se um sólido nas frações 9 a 20. Estas foram reagrupadas e a análise deste material por RMN indicou tratar-se de 3,16-dioxofriedelano (MS2; 227,0 mg). As frações 22 e 23 foram agrupadas (MS3; 27,0 mg) e análises por RMN indicaram tratar-se de 30-hidroxifridelan-3- ona.
Na Figura 5 (p.15) está esquematizada a elaboração de SEHT, apresentando os grupos de frações que levaram à obtenção dos compostos já mencionados previamente.
Figura 5: Compostos obtidos de SEHT por cromatografia em coluna. MS1: friedelina; MS2:
3,16-dioxofriedelano; MS3: 30-hidroxifridelan-3-ona.
1.3.2- Elaboração do extrato hexânico do tronco de Maytenus salicifolia
O extrato hexânico do tronco de M. salicifolia (EHT; 14,65 g) apresentou cor verde escura e consistência viscosa. Foi submetido à CC, utilizando-se 586,0 g de sílica-gel 60 (70- 230 Mesh) como fase estacionária e como fase móvel hexano, clorofórmio, acetato de etila e, finalmente, metanol, puros ou em misturas de polaridades crescentes. Foram obtidas 52 frações de aproximadamente 200 mL cada. As frações foram reunidas em 14 grupos de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico observado através de CCDS. O procedimento de purificação dos grupos estudados é descrito a seguir.
Grupo 6 (fração 29)
Adicionou-se hexano à fração 29 e observou-se a precipitação de sólido esverdeado. Este foi lavado com acetona e tornou-se branco. Após filtração e secagem, a análise dos espectros no IV e de RMN deste sólido (86,0 mg) e comparação com padrões permitiram identificá-lo como 3,16-dioxofriedelano (MS2).
SEHT 0,47 g Fração 3 MS1 13,0 mg Fração 7 293,0 mg Subgrupo 9-20 227,0 mg MS3 27,0 mg MS2 227,0 mg Subgrupo 22- 23
Grupo 7 (fração 30)
Esta fração (1,70 g) apresentou-se como um sólido verde escuro pastoso. A análise por CCDS deste grupo indicou que, além de clorofila, havia mais de uma substância presente. Este sólido foi então purificado por CC de sílica-gel 60 (58,0g) e como fase móvel foi utilizada a mistura de CHCl3/AcOEt nas seguintes proporções: (7:1), (6:1), (5:1) e (1:1),
finalizando com AcOEt (100%) e MeOH (100%). Foram coletadas 31 frações de 5,0 mL cada. Após análise por CCDS, foi possível reunir as frações em quatro grupos. O terceiro grupo (G3, frações 10 a 26) foi lavado com hexano, sendo observada a formação de um sólido branco. A análise por RMN indicou tratar-se de uma mistura onde o composto majoritário é o 28-hidroxilup-20(29)-en-3-ona (MS4, 30,0 mg).
Grupo 8 (fração 31)
Esta fração apresentou-se como um sólido branco (137,0 mg). Pela análise por CCDS observaram-se duas manchas na placa. Foi feita purificação por CC, utilizando como fase estacionária sílica-gel 60 (7,0 g) e como sistema eluente uma mistura de hexano e clorofórmio nas proporções de (8:2) e (1:1). Foram coletadas 25 frações de 5 mL cada. Agruparam-se as frações 5 a 12 e 15 a 23. Pela análise por CCDS e comparação com padrões, verificou-se que o primeiro grupo é lupeol (MS5, 93,0 mg) e o segundo é 3,16- dioxofriedelano (MS2, 34,0 mg).
Grupo 10 (frações 33 a 35)
O grupo 10 (25,0 mg) apresentou-se como um sólido de cor esverdeada, que após ser lavado com hexano, tornou-se branco. Pela análise por CCDS observou-se somente uma mancha na placa. Após análise por RMN, verificou-se que a substância isolada é o lupeol (MS5, 20,0 mg).
Grupo 11 (frações 37 e 38)
Este grupo apresentou-se como um sólido de cor esverdeada (20,0 mg), que foi purificado como o grupo anterior. Após confirmação estrutural por RMN, verificou-se que a substância isolada é a betulina (MS6; 13,0 mg).
Grupo 12 (fração 40)
Esta fração (2,48 g) apresentou-se como um sólido de cor esverdeada. Por análise por CCDS observou-se que havia mais substâncias presentes além da clorofila. Foi feita uma nova purificação por CC. Desta coluna, onde se utilizaram 100,0 g de sílica-gel 60 (70-230 Mesh) como fase estacionária e como eluente clorofórmio, acetato de etila e finalmente metanol, puros ou em misturas de polaridades crescentes, foram coletadas 67 frações de 5,0 mL cada. Estas foram reunidas em 14 grupos de acordo com a semelhança do perfil cromatográfico observado nas placas de CCDS. Entretanto, apenas os grupos 8 e 14 foram trabalhados devido à alta quantidade de clorofila presente nas outras frações e da pouca quantidade de material isolado. O grupo 8 (fração 41, 32,0 mg) apresentou-se como um sólido branco, insolúvel em clorofórmio. Através de análise por RMN e comparação com dados da literatura (ABDEL, 1999) concluiu-se que este composto é o lup-20(29)-en-3,30- diol (MS7; 32,0 mg). O grupo 14 (frações 66 e 67; 20,0 mg) foi identificado por comparação com padrões por CCD como sendo friedelina (MS1).
Na Figura 6 (p. 18) está esquematizada a elaboração de EHT, enfatizando os grupos de frações que levaram à obtenção dos compostos mencionados previamente.
Figura 6: Compostos obtidos de EHT por cromatografia em coluna. MS1: friedelina; MS2:
3,16-dioxofriedelano; MS4: 28-hidroxilup-20(29)-en-3-ona; MS5: lupeol; MS6: betulina; MS7: lup-20(29)-en-3,30-diol.