Intrigados com a estrutura química incomum e promessa terapêutica do ácido gambógico (1) e relacionados CGXs como agentes antitumorais, nosso grupo de pesquisa iniciou um projeto de pesquisa com o objetivo de desenvolver uma estratégia sintética para preparação dessa classe de compostos, identificar o mecanismo de ação e compreender as relações estrutura e atividade. Foi desenvolvida uma eficiente abordagem sintética para a preparação de CGXs, tendo como etapa chave as reações em cascata de Claisen/Diels-Alder (TISDALE et al. 2003; BATOVA et al. 2007; CHANTARASRIWONG et al. 2009; BATOVA et al. 2010; GUIZZUNTI, et al. 2012; ELBEL et al, 2013).
Para avaliar se todas as partes da estrutura base das CGXs são importantes na bioatividade, foram sintetizados diversos análogos simples das CGXs contendo pequenos fragmentos da estrutura base (BATOVA et al. 2007; CHANTARASRIWONG et al. 2009; BATOVA et al. 2010; ELBEL et al, 2013). Comparações de suas citotoxicidades indicou que a cluvenona (7, figura 3), um CGX sintético que apresenta a estrutura central das CGXs sem os grupos prenilas no anel A, apresentou uma bioatividade semelhante a apresentada pelo ácido gambógico (1).
Figura 3 Estrutura da cluvenona (7) e hidroxicluvenonas 8 e 9.
Esses estudos demonstraram que a cluvenona (7, figura 3) induziu o estresse e apoptose celular em várias linhas de células cancerígenas em concentrações micromolares, foi igualmente citotóxica em células resistentes e não foi citotóxica em células normais. Estudos de marcação fluorescente indicaram que tanto o ácido gambógico (1), quanto a cluvenona (7) localizaram- se na mitocôndria e induziram significantes alterações na morfologia e estrutura dessa organela, conduzindo assim a apoptose celular (GUIZZUNTI, et al. 2012;
GIANNI et al. 2012). Alguns estudos relataram que o ácido gambógico (1) induziu a degradação da proteína Hsp90, a qual tem um papel fundamental na proliferação de células cancerígenas (DAVENPORT et al. 2011). Esses estudos sugerem que esses compostos possuem um inexplorado mecanismo de ação que é diferente de outros agentes já conhecidos e possuem também um potencial farmacológico e clínico.
Posteriormente foram sintetizados as hidroxicluvenonas 8 e 9 (Figura 3), análogos da cluvenona (7), hidroxiladas nas posições C6 e C18 do anel A (a
numeração adotada na cluvenona (7) e seus derivados é baseada na numeração adotada na estrutura do ácido gambógico (1)), que também inibiram o crescimento celular em uma concentração micromolar e induziram a morte celular atuando na mitocôndria (ELBEL et al, 2013).
Tem sido proposto que a função enona em C9-C10 desses compostos
contribui para sua bioatividade, atuando como um eletrófilo conjugado e que a função β-hidroxi cetona presente na cluvenona hidroxilada em C6 pode atuar
como um quelante de metais (ZHANG et al. 2004; KUEMMERLE et al. 2008; LI
et al. 2007; WANG et al. 2009).
Em geral, os nossos estudos indicam que o anel A das CGXs é passível de funcionalização de um modo que não só modula o sítio de seletividade da reação em cascata de Claisen/Diels-Alder, mas também a sua potência biológica (ELBEL et al. 2013).
A figura 4 ilustra os estudos de relação estrutura e atividade com o ácido gambógico. A estrutura farmacofórica mínima das CGXs inclui o esqueleto tricíclico ABC derivado de xantonas e o anel oxa-tricíclico em C. Funcionalizações na periferia dessa estrutura base não são essenciais para a bioatividade, mas podem ser utilizadas para melhorar algumas características, como solubilidade e seletividade dessas CGXs. Contudo, redução e/ou substituições no carbono C10 (enona) reduziram a atividade das CGXs (CHANTARASRIWONG et al. 2009).
Figura 4 Representação do estudo da relação estrutura e atividade do ácido gambógico.
A continuidade nos estudos da relação estrutura e atividade para essa classe de compostos é importante para a obtenção de compostos mais ativos e auxílio no entendimento do seu mecanismo de ação.
3.2 OBJETIVOS
O objetivo geral desse trabalho foi continuar os estudos de relação estrutura e atividade iniciado pelo nosso grupo de pesquisa, sintetizando análogos da cluvenona (7) com modificações estruturais no anel A. Objetivou- se a síntese da di-hidroxicluvenona 10 (Figura 5), um candidato ideal para futuros estudos bioquímicos e biológicos, pois apresenta em sua estrutura uma hidroxila livre em C18 que permite futuras derivatizações, uma função β-hidroxi
cetona que atua como quelante de metais e a função enona em C9-C10 que
atua como um potente eletrófilo conjugado.
Figura 5 Estrutura da di-hidroxicluvenona 10.
Foi também objetivo desse trabalho a síntese dos compostos 37, 38, 40, 41, 42, 44, 45, 46 e 48 (Figura 6), derivados das hidroxi cluvenonas 8, 9 e 10. Os compostos 37, 38, 41, 42, 45 e 46 foram almejados por serem possivelmente mais solúveis em água, comparados com as hidroxi cluvenonas
de partida, devido à conjugação com derivados do trietileno glicol. Os compostos 40, 44 e 48 foram almejados devido à constatação de que cátions lipofílicos, tais como os sais de trifenilfosfina, auxiliam a penetração de pequenas moléculas na mitocôndria (BIASUTTO et al. 2008; CHALMERS et al. 2012). Como esses compostos atuam na mitocôndria, aumentar a concentração deles nessa organela poderia promover o aumento de suas atividades biológicas. Outro objetivo desse trabalho foi sintetizar a CGX 57 (Figura 6), um derivado que se caracteriza por apresentar a função p- benzoquinona no anel A. Objetivou-se a síntese desse composto com o intuito de avaliar a influência de grupos retiradores de elétrons no anel A de CGXs. A conjugação entre o anel derivado da benzoquinona (A) e a cetona presente no anel B aumentaria ainda mais a eletrofilicidade da enona em C9-C10, que é extremamente importante na atividade biológica dessa classe de compostos.
O último objetivo desse trabalho foi a síntese de um derivado da 6- hidroxicluvenona (8) com propriedades fluorescentes, com o intuito de realizar estudos de mecanismo de ação pela interação desses compostos com receptores específicos e localização subcelular através de microscopia fluorescente. Planejou-se a síntese do composto 76 (Figura 7), um derivado contendo a porção 6-hidroxicluvenona (estrutura em azul na Figura 7), um espaçador (estrutura em preto na figura 7) e uma unidade derivada de dipirrometenoboro, o BODIPY FL EDA (estrutura vermelha na figura 7). O BODIPY FL EDA (Figura 7) é um composto comercial que possui propriedades espectrais similares em comprimento de onda e intensidade com a fluoresceína. No entanto, derivados do BODIPY apresentam larguras de bandas mais estreitas que a fluoresceína, não apresentam uma apreciável sensitividade com o pH, possuem uma maior solubilidade em solventes não polares e apresentam uma maior fotoestabilidade (HAUGLAND et al. 1987).
Figura 7 Estrutura do BODIPY FL EDA e do composto com propriedades fluorescentes 76.
Optou-se pela utilização do BODIPY FL EDA devido à presença de um grupo amino nesse composto, permitindo realizar o acoplamento com um derivado ácido carboxílico da hidroxicluvenona (8) através de uma reação de amidação. O BODIPY FL EDA é um composto extremamente caro e não há relatos na literatura da síntese desse composto. Diante dessas informações planejou-se a síntese do BODIPY FL EDA e posterior acoplamento com o derivado da hidroxicluvenona (8). Inicialmente seriam avaliadas as
propriedades citotóxicas de 76, e se esse composto apresentar atividade semelhante àquelas das hidroxicluvenonas, seriam realizados os ensaios de localização e interação com os receptores específicos.
3.3 RETROSSÍNTESE
A retrossíntese para obtenção da di-hidroxicluvenona (10) e seus derivados 37, 38 e 40 está representada no esquema 3. Os compostos 37, 38 e 40 poderiam ser obtidos a partir da di-hidroxicluvenona (10) através de reações de alquilação ou esterificação na hidroxila em C18. Através de rearranjo de Claisen, seguido de Diels-Alder e desproteção da xantona 18b, a di- hidroxicluvenona (10) poderia ser preparada. Planejou-se a síntese da xantona 18b a partir da reação de acilação entre o ácido 2,3,4-tri-hidroxibenzílico (11) e o 1,3,5-tri-hidroxibenzeno (12), seguido de uma ciclização, conduzindo a formação de 13, e posteriores reações de proteção, desproteção e alilação (Esquema 3).
Esquema 3 Esquema retrossintético para obtenção da di-hidroxicluvenona 10