No intuito de investigar o possível envolvimento de vias neurais no fenômeno em estudo, desenvolveu-se uma série de experimentos com animais previamente submetidos à desnervação cirúrgica, seja do nervo vago ou dos nervos esplâncnicos.
4.4.1 Vagotomia subdiafragmática
Os animais deste grupo foram inicialmente submetidos a um jejum por 24 horas, mantendo-se o livre acesso à água. Após anestesia com éter, os animais foram submetidos a laparotomia mediana seguida da exposição do esôfago abdominal. Em seguida, os animais foram distribuídos em 2 grupos, a saber: Grupo falsa vagotomia subdiafragmática e PIC 10 mmHg (N=5) e Grupo vagotomia subdiafragmática e PIC 10 mmHg (N=6).
No grupo Falsa vagotomia subdiafragmática + PIC 10 mmHg, os ratos sofreram uma incisão abdominal mediana, seguida de exposição do esôfago abdominal, mantendo-se os nervos vagos intactos. Em seguida, os animais foram mantidos em gaiolas individuais com livre acesso à água e alimentação por mais 48 horas, quando então foram submetidos a novo jejum de 24 horas. Em seguida, os animais foram submetidos às mesmas etapas e procedimentos cirúrgicos citados na secção anterior. Por ocasião do experimento, após o período basal, a PIC foi aumentada e mantida em 10 mmHg por 30 minutos com o auxílio de um manômetro,
Basal H20’ H40’ H60’ - 1 dia 0 20 40 60 80 min Jejum Procedimentos cirúrgicos Elevação da PIC até 20 mmHg
Elevação da PIC até 60 mmHg Elevação da PIC
sendo os registros agrupados em 3 períodos de 10 minutos, denominados H10, H20 e
H30. A seguir, o sistema de infusão de LCR-símile foi fechado, permitindo a livre
flutuação da PIC. Os valores do VG e dos parâmetros hemodinâmicos monitorados nos 30 minutos posteriores foram agrupados em 3 períodos consecutivos de 10 minutos, doravante denominados de: R10, R20 e R30.
No grupo Vagotomia subdiafragmática + PIC 10 mmHg, os ratos foram tratados de forma idêntica, exceto, quando sofreram a laparotomia, foram submetidos a vagotomia troncular subdiafragmática, realizada por meio da serotomia do esôfago cerca de 1 a 1.5 cm acima do cárdia, seguida da instilação de álcool a 100%, segundo TACHÉ & MAEDA-HAGIWARA (1987). A vagotomia foi imediatamente confirmada por meio de inspeção com uma lente de aumento (10x) (Figura 13).
FIGURA 13 – Representação esquemática do delineamento experimental empregado
para o estudo das variações do volume gástrico registradas por meio de pletismografia em ratos anestesiados submetidos ao pré-tratamentos cirúrgicos laparotomia seguida ou não (falsa-cirurgia) de vagotomia subdiafragmática e estudados frente à elevação da pressão intracraniana de 10 mmHg – H = hipertensão; R = recuperado
4.4.2 Esplancnicectomia
Os animais deste grupo foram inicialmente submetidos a um jejum por 24 horas, mantendo-se o livre acesso à água. Após anestesia com éter dietílico os animais foram submetidos a laparotomia mediana com exposição das vísceras abdominais e do tronco celíaco. Em seguida, os animais foram distribuídos em 2 grupos, a saber: Grupo falsa esplancnicectomia + Gangliectomia celíaca e PIC 10 mmHg (N=5) e Grupo esplancnicectomia + Gangliectomia celíaca e PIC 10 mmHg (N=6).
No grupo Falsa esplancnicectomia + Gangliectomia celíaca e PIC 10 mmHg, após a visualização do tronco celíaco e dos nervos esplâncnicos, a cavidade abdominal foi fechada. Vinte e quatro horas depois, os animais foram submetidos às
Basal H
10 H20 H30 R10 R20 R30 - 4 dias - 3 dias - 2 dias - 1 dia 0 20 30 40 50 60 70 80 min
Jejum (Falsa) Vagotomia Subdiafragmática Procedimentos cirúrgicos Elevação da PIC até 10 mmHg Jejum
mesmas etapas e procedimentos cirúrgicos citados na secção anterior. Por ocasião do experimento, após o período basal, a PIC foi aumentada e mantida em 10 mmHg por 30 minutos com o auxílio de um manômetro, sendo os registros agrupados em 3 períodos de 10 minutos, denominados H10, H20 e H30. A seguir, o sistema de infusão
de LCR-símile foi fechado, permitindo a livre flutuação da PIC. Os valores do VG e dos parâmetros hemodinâmicos monitorados nos 30 minutos posteriores foram agrupados em 3 períodos consecutivos de 10 minutos, doravante denominados de: R10, R20 e R30.
No grupo Esplancnicectomia + Gangliectomia celíaca e PIC 10 mmHg, os animais foram tratados de forma idêntica, exceto, quando sofreram a laparotomia, foram submetidos a esplancnicectomia, realizada por meio de dissecção, seguida da secção do gânglio celíaco e dos nervos esplâncnicos, segundo TACHÉ & MAEDA- HAGIWARA (1987). A esplancnicectomia foi imediatamente confirmada por meio de inspeção com uma lente de aumento (10x) (Figura 14).
FIGURA 14 – Representação esquemática do delineamento experimental empregado
para o estudo das variações do volume gástrico registradas por meio de pletismografia em ratos anestesiados submetidos aos pré-tratamentos cirúrgicos laparotomia seguida ou não (falsa-cirurgia) de esplancnicectomia + gangliectomia celíaca e estudados frente à elevação da pressão intracraniana de 10 mmHg – H = hipertensão; R = recuperado
4.5 Avaliação histológica
Um grupo à parte de animais foi submetido aos mesmos protocolos descritos anteriormente para os grupos Controle (n=3), PIC 10 mmHg (n=3) e PIC 60 mmHg (n=3).
Ao final dos 80 minutos de monitoração, os animais tiveram seus cérebros retirados para confecção de cortes histológicos. Para tanto, os animais, ainda em plano anestésico, foram submetidos à laparotomia mediana e toracotomia ântero-
Basal H10 H20 H30 R10 R20 R30
- 2 dia - 1 dia 0 20 30 40 50 60 70 80 min Jejum (Falsa) Esplancnicectomia + Gangliectomia Celíaca Procedimentos cirúrgicos
Elevação da PIC até 10 mmHg Jejum
lateral esquerda. Após obstrução da aorta abdominal e livre acesso ao ventrículo esquerdo, foi realizada a injeção intracardíaca de solução de formol (~60 ml) a 10%. A seguir, os animais foram decapitados e após craniotomia foram retirados os cérebros, que permaneceram imersos por 24 h em solução de formol a 10% para fixação do tecido (vide composição em anexos).
A seguir, as peças foram submetidas a sucessivos processos de desidratação (em álcool etílico nas concentrações de 70%, 80% e 90% por 1 h, respectivamente, seguido de álcool etílico absoluto por 3 h), clarificação (banhos de xilol consecutivos de 30 min), impregnação (preparo em parafina líquida) e inclusão.
Foram realizados 5 cortes coronais por animal, na topografia dos ventrículos laterais (próximos à incisão cirúrgica), na espessura de 5 µm. As lâminas foram coradas pelo método hematoxilina-eosina (HE) e analisadas à microscopia óptica por neuropatologista credenciado, sem identificação do protocolo empregado. Segundo BIGIO et al. (1994), observaram-se na análise histológica os seguintes parâmetros: presença de edema parenquimatoso, presença de congestão meníngea, presença de congestão parenquimatosa, presença de congestão do plexo coróide, presença de hemorragia parenquimatosa, presença de hemácias na cavidade ventricular, presença de necrose/apoptose e presença de lesão neuronal. Ainda segundo BIGIO et al. (1994), foi anotado para cada um destes parâmetros um escore de acordo com a seguinte gradação:
a) grau 0: ausente b) grau 1 (+): leve
c) grau 2 (++): moderada d) grau 3 (+++): acentuada
e) grau 4 (++++): muito acentuada
4.6 Cuidados pós-experimentais
Ao final de cada experimento, todos os animais, ainda em plano anestésico, foram sacrificados por meio de injeção i.v. de solução concentrada de KCl. A seguir, o posicionamento do balão no estômago foi conferido após laparotomia mediana e dissecção das vísceras abdominais, sendo o volume contido no balão aspirado e medido por meio de proveta graduada em 0.1 ml. Para verificar o posicionamento
dos cateteres nas cavidades ventriculares, foi injetado através desses cateteres o corante azul de Evans.
FIGURA 15 – Imagem fotográfica de cortes coronais mostrando o sistema
ventricular corado pelo azul de Evans, evidenciando o posicionamento dos cateteres nas cavidades ventriculares. Escala: 0,5 cm equivale a 1 mm.
4.7 Análise estatística
Os dados foram expressos como Média ± Erro Padrão da Média. Os valores de VG foram representados na forma de figuras do tipo Box and Wiskers Plots. A análise de variância (ANOVA) para médias repetidas seguida pelo teste de Bonferroni foi utilizada na comparação estatística dos resultados. Os dados encontrados na análise histológica foram reportados como mediana e variações extremas e submetidos ao teste de Kruskal-Wallis. (BLAND, 1995).