Peptídios sintéticos foram obitdos da Genscript (Piscataway, NJ). A pureza destes foi determinada como sendo: TEWETGQI (95%); PETLGHEI (97.4%);
YEIVAGYI (99.40%); TPTAGLVGF (98.6%); GSRNGNDRL (97.1%); ESKSGDAPL (96.1%); HEHNLFGI (98.7%); ESSTPTAGL (99.1%); ESEPKRPNM (98.7%); VSWGEPKSL (99.2%); YSDGALHLL (97.3%); AESWPSIV (96.5%); e RPNMSRHLF (99.4%); e VNHRFTLV (>90%).
O pentâmero H2Kb-VNHRFTLV foi obtido da ProImmune Inc. (Oxford, UK).
3.21.2 ELISPOT
Para o ensaio de ELISPOT, foram utilizadas placas de nitrocelulose de 96 poços (Multiscreen HA, Milipore) cobertas com 60 µl/poço de PBS estéril contendo 10 µg/mL do anticorpo monoclonal anti-IFN-γ de camundongo (R4-6A2, Pharmingen). Após incubação durante a noite a temperatura ambiente, a solução contendo o anticorpo monoclonal será removida por aspiração em ambiente estéril e as placas foram então lavadas por 3 vezes com RPMI. As placas foram bloqueadas pela incubação dos poços com 100 µL do meio RPMI contendo 10 % de soro fetal bovino por, pelo menos, 2 h a 37 ºC.
As células respondedoras foram obtidas do baço de camundongos imunizados e/ou imunizados e infectados com T. cruzi. Estas células foram lavadas 3 vezes em meio RPMI e então ressuspendidas em meio RPMI completo na concentração de 0.2 a 1x106 células viáveis/ml. O meio completo contém 1% de
NEAS, L-glutamina, vitaminas e piruvato, 5X10-5 M 2-ME, 10% de soro fetal bovino
(Hyclone) e 30 U/mL de interleucina-2 humana recombinante (cedida por Hoffman- La Roche).
As células apresentadoras foram obtidas do baço de camundongos normais. O mesmo procedimento descrito acima foi feito, sendo que a concentração destas foi de 3.5x106 células viáveis/mL. Cem microlitros da suspensão contendo células respondedoras e 100 µL da contendo células apresentadoras de antígeno foram adicionadas em cada poço. A placa foi incubada em condições estáticas por 24 h a 37 ºC em atmosfera contendo 5% de CO2. As estas culturas foi adicionado 20 µL de
meio de cultura ou meio de cultura contendo o peptídio sintético indicado. A concentração final de peptídio em cultura foi de 10 µg/mL. Foram utilizados os peptídios IYNVGQVSI, VNHRFTLV, ANYDFTLV, ANYKFTLV, YEIVAGY e TEWETGQI (todos obtidos da GeneScript, USA).
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Depois da incubação, as células foram desprezadas. Para remover quaisquer células residuais, as placas foram lavadas por 3 vezes com PBS e 5 vezes com PBS-Tween 20. Cada poço recebeu então 75 µL do anticorpo monoclonal anti-IFN-γ de camundongo biotinilado XMG1.2 (Pharmingen) diluído em PBS-Tween 20 na concentração final de 2 µg/mL. As placas foram incubadas durante a noite a 4 ºC. Os anticorpos não ligados foram removidos pela lavagem das placas por 6 vezes com PBS-Tween 20. Adicionamos então estreptoavidina-peroxidase (KPL) na proporção de 1:800 em PBS-Tween 20, em volume final de 100 µl/poço. As placas foram incubadas por 1-3 h a ta e então lavadas de 3 a 5 vezes com PBS-Tween 20 e mais 3 vezes com PBS. As placas foram reveladas adicionando-se 100 µL/poço do substrato da peroxidase (50mM Tris-HCl, pH 7.5, contendo 1 mg/ml de DAB e 1 µL/mL de 30 % de peróxido de hidrogênio, ambos da SIGMA). Depois de uma incubação de 15 min a temperatura ambiente, a reação foi interrompida descartando-se a solução substrato e lavando-se as placas com água corrente. As placas foram então secas a ta e o número de células produtoras de IFN-γ foram estimadas com a ajuda de uma lupa.
3.21.3 Ensaio de citotoxicidade in vivo
Suspensões de células foram preparadas do baço de camundongos normais. Os eritrócitos foram lisados usando tampão de lise (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1
Mm Na EDTA, pH 7.2-7.3). Depois de duas lavagens com RPMI, as células foram ressuspensas em meio R10 % - RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o corante Azul de Tripan (0.2%) como discriminante entre células vivas e mortas. A concentração das células foi estimada em câmara de Neubauer. Metade dos esplenócitos foram corados com 0.5 µM (CFSElow) e a outra metade com 5 µM (CFSEhigh) de CFSE (Molecular Probes) em PBS por 15 min a 37 ºC. Após centrifugação, as células foram ressuspensas em R10% pré-aquecido. A população alvo CFSEhigh foi pulsada com 10 µg/mL do peptídio específico. As células foram incubadas com o peptídio em meio R10% por 40 min a 37 ºC, lavadas extensivamente, ressuspendidas em R10% e contadas novamente. Ambas populações de CFSE foram misturadas na concentração de 1:1, centrifugadas, ressuspensas em RPMI e injetadas intravenosamente (via retro-
orbital) em camundongos numa concentração de 1-2 x107 células/camundongo.
Depois de aproximadamente 20 horas, os baços dos camundongos que receberam as células marcadas foram retirados, e as suspensões de células foram fixadas em PBS contendo 3.7% de paraformaldeído por 10 min a temperatura ambiente. Após uma lavagem com PBS, foram ressuspensas em tampão de FACS. Cada grupo experimental consistiu de três ou mais animais, e cada camundongo foi analisado individualmente. As populações de linfócitos CFSElow e CFSEhigh foram detectadas no baço via citometria de fluxo, usando o FACScan e analisadas com o software CellQuest (Becton Dickinson). A porcentagem de lise específica para o peptídio foi determinada pela fórmula:
1 – % CFSEhigh infectado / % CFSElow infectado X 100 %.
% CFSEhigh naïve / % CFSElow naïve
3.21.4 Determinação do numero de células CD8+ esplênicas especificas pela coloração com o pentâmero H-2Kb-VNHRFTLV
Suspensões de células foram preparadas do baço através do processo de maceração. Os eritrócitos foram lisados usando tampão de lise (0.15 M NH4Cl, 1mM
KHCO3, 0.1Mm Na EDTA, pH 7.2-7.3). Depois de duas lavagens com RPMI, as
células foram ressuspendidas em meio R10% - RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o corante Azul de Tripan (0.2%) como discriminante entre células vivas e mortas. A concentração das células foi estimada em câmara de Neubauer.
As células foram ressuspendidas em tampão MAC’s e coradas com os multímeros H-2Kb-VNHRFTLV seguindo as instruções do fabricante. O número de linfócitos T CD8 específicos foram determinado por fluorescência com ajuda de um aparelho de citofluorometria (FACS) da BD (52).
3.21.5 Isolamento de linfócitos, coloração na superfície celular e coloração intra-
celular (ICS)
Suspensões de células foram preparadas do baço através do processo de maceração. Os eritrócitos foram lisados usando tampão de lise (0.15 M NH4Cl, 1 mM
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células foram ressuspendidas em meio R10 % - RPMI 1640 com 10 % de soro fetal bovino. A viabilidade das células foi avaliada utilizando o corante Azul de Tripan (0.2%) como discriminante entre células vivas e mortas. A concentração das células foi estimada em câmara de Neubauer. As células foram ressuspendidas em tampão MAC’s e coradas para os antígenos de superfície de acordo com a diluição sugerida pelo fabricante. Ou então, as células foram colocadas em cultura em meio DMEM suplementado com ou sem estímulo (10 µg/ml de peptídio) a 37 °C em 5% CO2 por
12h. A estas culturas foi adicionado o anticorpo anti-CD28 (2 µg/mL), anti-CD107a (Clone 1D4B, 2 µg/mL; BD Pharmingen), 5 µg/mL de monensina (BD Biosciences) e 10 µg/mL de brefeldina A (BD Biosciences). Depois de 12h de incubação, as células foram coradas para superfície com anti-CD8 marcado com PerCP ou PE, no gelo por 20 min. Para detectar IFN-γ e TNF-α por ICS, as células foram lavadas duas vezes em tampão contendo PBS, 0.5% BSA, e 2 mM EDTA, fixadas em uma solução de 4% de PBS-paraformaldeído por 10 min, e permeabilizadas por 15 min em PBS, 0.1% BSA, e 0.1% saponina. Após serem lavadas duas vezes, as células foram coradas com anti-IFN-γ marcado com APC ou PE (Clone XMG1.2), anti-TNF- α marcado com PE (clone MP6-XT22), anti-IL-2 marcado com APC (clone JES6- 5H4) ou anti-IL-10 marcado com APC (JES5-16E3) por 20 min no gelo. Finalmente, as células foram lavadas duas vezes e fixadas em 1% PBS-paraformaldehído. A fluorescência celular foi medida com um FACSCanto II ou FACSCalibur (BD Biosciences) e os dados foram analisados através do software FlowJo (TreeStar, Inc.).