Medidas de fluorescência

Neste trabalho foram realizados dois tipos de medidas de fluorescência, medidas em estado estacionário e medidas resolvidas no tempo, usando células de quartzo de 1 cm X 0,4 cm com a orientação do maior percurso ótico na excitação. Isto é, a excitação foi realizada ao longo da face de 1 cm e a emissão recolhida segundo a face dos 0,4 cm. Este procedimento permite aumentar a intensidade do sinal recolhido.

O procedimento realizado foi para todas as amostra igual, à exceção dos comprimentos de onda usados e das fendas de excitação e emissão (passarão a ser designadas apenas por fendas, uma vez que tiveram sempre a mesma largura). Estes parâmetros para os compostos e sondas fluorescentes foram em todas as experiências os mesmos e estão referidos nas Tabelas 2 e 3.

Cada estudo efetuado continha os respetivos brancos4_{, que foram descontados a cada}

amostra. A contribuição do branco é expressa em percentagem e corresponde a fenómenos inerentes à própria amostra, como são casos de dispersão elástica de luz e dispersão de Raman. As percentagens de branco obtidas ao longo deste trabalho foram inferiores a 20%, exceto quando se trata de compostos pouco fluorescentes, como o caso do complexo S10, ou do ligando bpy e do complexo OR6 na presença de bicamadas lipídicas, em que se obtiveram percentagens de branco mais elevadas (cerca de 60%).

4.3.1 Medidas de fluorescência em estado estacionário

As medidas de fluorescência em estado estacionário foram de três tipos: Espectros de excitação/emissão, intensidade de fluorescência (a comprimentos de onda fixos) e anisotropia. Estas foram realizadas no espectrofluorímetro Spex Fluorolog— 3 v2.2, com monocromadores duplos na excitação e na emissão e em geometria de ângulo reto. A fonte de luz é uma lâmpada de xénon de 450 W que emite fotões a um fluxo constante, isto é, uma quantidade constante de fotões por unidade de tempo. Sob uma fonte de luz constante, a concentração de fluoróforos excitados mantem-se constante, e daí que nestas condições as medidas se designem por medidas em estado estacionário. Foi usado como referência um fotodíodo.

Uma vez que a intensidade de fluorescência é proporcional à concentração da amostra apenas para baixas absorvências [71] as amostras utilizadas para estudos de fluorescência não tinham absorvência superior a 0,1 nos comprimentos de onda de interesse. As concentrações dos compostos foram ajustadas de forma a que este requisito fosse cumprido.

4 _{Em cada protocolo serão referidas as constituições dos brancos. No entanto, de um modo geral, o branco} refere-se a uma amostra em que não há adição do composto ou da sonda.

38

4.3.1.1 Espectros de excitação e emissão

Para obtenção de espectros de excitação e emissão não foram usados polarizadores e foram efetuados com um tempo de integração de 0,2 s, com fendas ajustadas à intensidade de sinal da amostra de forma a não saturar o detetor. As fendas usadas para as sondas e compostos fluorescentes estão referidas na Tabela 2 e os respetivos comprimentos de onda de excitação e emissão na Tabela 3.

Tabela 2: Fendas para os compostos fluorescentes e sondas em estado estacionário e transiente para a

obtenção de espectros, medidas de anisotropia e decaimentos de intensidade de fluorescência. Fendas (nm)

Nome Espectros Anisotropia

Decaimentos de intensidade de fluorescência So n d a DPH 2 5 5 t-PnA 2 5 5 Di-4-ANEPPS 2 5 15 C o mpo sto OR6 4 10 15 pbt 2 5 6 bpy 4 15 15 Salan 4-MeO 4 10 15 Salan 5-MeO 4 10 15

Os espectros de excitação podem ser distorcidos por variações na intensidade da luz de excitação, sendo estas variações devidas à dependência do comprimento de onda com a intensidade da lâmpada, e pela eficiência de transmissão do monocromador de excitação. Já os espectros de emissão são distorcidos pela dependência do comprimento de onda com a eficiência do monocromador de emissão e pela resposta do detetor (tubo fotomultiplicador). Posto isto, a correção dos espectros obtidos é importante, principalmente em casos de medidas quantitativas [71]. As variações na intensidade da luz de excitação foram efectudas através da divisão pelo sinal da referência, enquanto que as restantes distorções foram corrigidas através da aplicação de ficheiros de correção disponibilizados pelo fabricante.

4.3.1.2 Intensidade de fluorescência

As determinações da intensidade de fluorescência a um comprimento de onda fixo foram realizadas sem polarizadores e repetidas 10 vezes para cada amostra. A cada valor de intensidade de fluorescência foi subtraído o valor da média da intensidade de fluorescência do respetivo branco. As medidas foram usadas na determinação dos coeficientes de partição membrana/água (Kp) dos compostos.

39

4.3.1.3 Anisotropia de fluorescência

As medições de anisotropia foram feitas usando o espetrofluorímetro já mencionado, recorrendo-se ao uso de polarizadores Glan-Thomson, estando as fendas, mais uma vez referenciadas na Tabela 2. Os valores de anisotropia apresentados correspondem à medida de pelo menos três replicados e foram calculados através da Equação 2. Em cada replicado foram realizadas sete medidas, e a cada uma delas descontada a média das sete medidas obtidas para o branco.

4.3.2 Medidas de fluorescência em estado transiente

Nas medidas em estado transiente usou-se o Fluorohub v2.0 acoplado ao espetrofluorímetro usado para as medidas em estado estacionário que permite obter decaimentos temporais de fluorescência pela técnica de cronometragem de um fotão único. Neste caso a excitação foi feita por um nanoLED pulsado e a deteção com um tubo fotomultiplicador TBX-04 com resolução de 50 ps.

O comprimento de onda dos nanoLEDs foi o mais próximo possível do comprimento de onda de excitação da amostra em causa e a emissão recolhida ao comprimento de onda de emissão máximo. Estas condições estão representadas na Tabela 3 e as fendas são mencionadas Tabela 2 (neste caso apenas foi necessário controlar as fendas de emissão, uma vez que a radiação emitida pelo nanoLED é essencialmente monocromática). Apenas referir que quando se utilizou a sonda DPH a emissão foi recolhida a 450 nm. Este comprimento de onda não corresponde ao máximo de emissão do DPH, mas utilizou-se este uma vez que com a excitação a 370 nm (nanoLED 370 nm) a dispersão de Raman, devida à vibração de estiramento simétrico do O-H da água, ocorre a um comprimento de onda muito próximo do máximo de emissão da sonda DPH (430 nm).

A escala de tempo usada, para a obtenção de todos os decaimentos obtidos neste trabalho, foi de 55517 ps/canal. O número de contagens no canal máximo foi de 10000 ou 20000 (as contagens mais baixas foram utilizadas para amostras em que o tempo de aquisição era superior a 20 min, devido à sua baixa intensidade de fluorescência). Para a seleção dos comprimentos de onda de emissão foi usado o mesmo monocromador que nas medidas em estado estacionário. Os parâmetros de ajuste dos decaimentos foram obtidos usando o programa Time- Resolved fluorescence Anisotropy (TRFA) Data Processor v.1.4 (Minsk, Belarus) e a sua qualidade avaliada através do valor do χ2 _{reduzido, e dos gráficos de resíduos relativos e de auto-correlação}

40

distribuição dos resíduos e auto-correlação foi aleatória em torno de zero. Foi preciso a soma de duas a quatro exponenciais para descrever os decaimentos de intensidade de fluorescência. Para os decaimentos das sondas de membrana utilizou-se uma dispersão de scaterring – Ludox® (sílica coloidal) para a desconvolução do pulso de excitação e, foram analisados em simultâneo a amostra, o branco e o dispersante. Relativamente aos decaimentos dos compostos fluorescentes teve de se recorrer a um padrão de tempos de vida de fluorescência (Rodamina B em metanol [71]), uma vez que o tempo de vida de fluorescência era bastante curto e não se conseguiu fazer uma análise fidedigna com uso do dispersante para a desconvolução. No método de análise dos decaimentos com uso de um padrão (método da referência), é necessário analisar previamente o decaimento do padrão (Rodamina-B) e determinar o seu tempo de vida, que foi próximo do valor indicado na literatura para as mesmas condições experimentais. O valor da literatura é de 2,53 ns [71] e nas diversas análises que se realizaram obtivemos valores entre 2,52 e 2,54 ns. Posto isto, para analisar os decaimentos dos compostos analisou-se em simultâneo a amostra, o branco e o padrão (cujo valor do tempo de vida foi necessário introduzir no programa de análise).

Tabela 3: Comprimentos de onda de excitação e emissão utilizados em estado estacionário e transiente

para as sondas de membrana e compostos em estudo.

Estado Estacionário Estado Transiente

Nome λex (nm) λem (nm) λex (nm) (nanoLED) λem (nm) So n d a DPH 360 430 370 + filtro UGI (Jobin Yvon) 450 t-PnA 470 635 315 635 Di-4-ANEPPS 303 404 460 404 C o mpo sto OR6 312 [15] 380 [15] 320 320 pbt 310 372 320 372 bpy 280 340 279 320 S10 290 340 Salan 5-MeO 290 328 279 328 Salan 4-MeO 277 304 279 304

41