As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases dependentes de zinco, que coletivamente são capazes de degradar essencialmente todos os componentes da matriz extracelular (CURRAN, MURRAY, 2000; O’CHAROENRAT et al., 2002; SOUZA, LINE, 2002; PALOSAARI et al., 2003; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005; VICENTE et al., 2005).
As primeiras MMPs foram identificadas em 1962, quando pesquisadores observaram que a reabsorção da cauda de girinos durante a metamorfose se dava por meio de atividade enzimática, que tinha a habilidade de degradar colágeno em pH neutro (STAMENKOVIC, 2000; PARDO, SELMAN, 2005).
Atualmente já está bem estabelecido que também em seres humanos as MMPs são requeridas em diversas circunstâncias fisiológicas, como na embriogênese, reparo de feridas, remodelação óssea, ovulação e involução pós-parto (WESTERMARCK,
KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000; SOUZA, LINE, 2002; RUNDHAUG, 2003; IKEJIRI et al., 2005).
Tem sido relatado que em diversas enfermidades se observa aumento da expressão ou atividade de MMPs, como em neoplasias, artrite reumatóide, osteoartrite, dermatoses bolhosas auto-imunes, periodontites, desordens da articulação têmporo- mandibular, entre outras (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000; GEARING et al., 2002; SOUZA, LINE, 2002; KIVELÄ-RAJAMÄKI et al., 2003; TSAI et al., 2003; PEREIRA et al, 2005).
As metaloproteinases são, em geral, constituídas por domínios bem conservados: um peptídeo sinalizador, um pró-peptídeo cuja clivagem proteolítica é necessária para a ativação enzimática, um domínio catalítico com um sítio de ligação para o zinco e um domínio c-terminal hemopexina, envolvido em interações com outras MMPs e inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Algumas MMPs exibem domínios adicionais ou pequenas inserções (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; WESTERMARCK, KAHARI, 1999; SOUZA, LINE, 2002; RUNDHAUG, 2003).
A expressão de MMPs é firmemente regulada, uma vez que seu efeito é potencialmente devastador (CURRAN, MURRAY, 2000). Esta regulação ocorre pelo menos em três níveis: transcricional, ativação proteolítica da pró-enzima e inibição da atividade enzimática (STAMENKOVIC, 2000; NABESHIMA et al., 2002; POLETTE et al., 2004).
A regulação transcricional das MMPs parece representar um etapa essencial, pois a maioria das metaloproteinases tem seus genes expressos apenas quando há remodelação tecidual ativa, fisiológica ou patológica (CURRAN, MURRAY, 2000; SOUZA, LINE, 2002). Vários fatores podem estar envolvidos nesta regulação, como citocinas, hormônios, fatores de crescimento e até mesmo fragmentos resultantes da clivagem da MEC por MMPs (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; O’TOOLE, 2001; NABESHIMA et al., 2002).
As metaloproteinases são, em grande parte, secretadas na forma de precursores latentes, denominados pró-enzimas ou zimogênios, que precisam ser clivados no pró-
domínio n-terminal para assumirem a forma ativa. Esta clivagem é usualmente realizada por proteinases serinas, como a plasmina e tripsina, e ocasionalmente por outras MMPS (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000; STAMENKOVIC, 2000; MYOUNG et al., 2002; SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004; VICENTE et al., 2005).
Finalmente, a regulação da atividade proteolítica das MMPs pode ser feita através de inibidores fisiológicos, especialmente pelos inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs), que são capazes de bloquear especificamente as formas ativas de MMPs (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000).
A inibição das MMPs pelos TIMPs se dá pela formação de complexos enzima- inibidor. A extensão da degradação da MEC pelas metaloproteinases, tanto em condições fisiológicas quanto em eventos patológicos, é determinada pelo balanço entre MMPs e TIMPs (KUMAMOTO et al., 2003; RAUVALA, PUISTOLA, TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005).
Há atualmente quatro membros conhecidos desta família: TIMP-1, 2, 3 e 4, que exibem 30 a 40% de homologia na cadeia de aminoácidos e possuem 12 resíduos de cisteína conservados (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000).
Apesar dos TIMPs serem os maiores inibidores das MMPS, este não é seu único efeito biológico, pois algumas destas proteínas também induzem alterações na morfologia celular, estimulam o crescimento de vários tipos de células, estão envolvidas no desenvolvimento de células germinativas e têm efeito na angiogênese (WESTERMARCK, KAHARI, 1999). De acordo com Turpeenniemi-Hujanen (2005), os TIMPs são capazes de reduzir a angiogênese tumoral, crescimento, migração e metástase em modelos experimentais.
As metaloproteinases de matriz são abundantemente expressas em variadas neoplasias malignas e estão implicadas em todos os estágios de sua progressão (IKEJIRI et al., 2005). Interessantemente, tem sido demonstrado que, em significativo número de casos, estas MMPs são expressas nas células estromais, tornando evidente que as células
tumorais, além da produção endógena de MMPs, são capazes de utilizar as proteinases produzidas por células do estroma (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; ZUCKER et al., 2001; LYNCH, MATRISIAN, 2002; O’CHAROENRAT et al., 2002).
Apesar de estar claro que a associação entre as metaloproteinases e a progressão neoplásica está diretamente relacionada com a sua capacidade de romper as barreiras físicas representadas pela membrana basal e MEC intersticial, as metaloproteinases também participam de outros processos do desenvolvimento tumoral, como a regulação da angiogênese e proliferação celular através da modulação de fatores de crescimento e citocinas armazenadas na MEC (KUSUKAWA et al., 1996; HAAS, MADRI, 1999; ZUCKER et al., 2001; FRANCHI et al., 2002).
De acordo com Curran e Murray (2000), diferentes MMPs são capazes de interagir com moléculas de adesão celular, de variadas classes, facilitando o movimento de células através da matriz extracelular.
Conforme Lynch e Matrisian (2002), as metaloproteinases de origem tumoral ou estromal podem processar moléculas da superfície celular, proteínas da MEC ou fatores de crescimento e citocinas armazenados na matriz extracelular, causando alterações no microambiente e favorecendo o crescimento tumoral, migração, invasão, angiogênese e seleção de clones celulares resistentes a apoptose. Para estes autores, as MMPs podem ser utilizadas como um meio de comunicação pelas células tumorais e estromais.
As metaloproteinases parecem estar envolvidas também na imunossupressão associada ao câncer. Sheu te al. (2001) demonstraram que as MMPs podem induzir a clivagem proteolítica de IL-2Rα em células T ativadas e suprimir a capacidade proliferativa destas células.
Assim, as metaloproteinases são importantes para a criação de um ambiente que facilite o início e manutenção do crescimento de tumores primários e metastáticos (CHAMBERS, MATRISIAN, 1997).
Regulação positiva na expressão de várias MMPs tem sido encontrada em câncer humano e parece estar correlacionada a estágio avançado, invasividade, metástase e pobre prognóstico (RUNDHAUG, 2003).
Com base em sua estrutura e especificidade de substrato, as MMPs são divididas em cinco grupos principais: colagenases, gelatinases, estromelisinas, tipo-membrana e outras metaloproteinases, incluindo as matrilisinas (WESTERMARCK; KAHARI, 1999, SOUZA; LINE, 2002). De acordo com Thomas, Lewis e Speight (1999), as MMPs exibem um alto grau de similaridade estrutural entre si, havendo respectivamente cerca de 80% e 50% de homologia na seqüência de aminoácidos intra e inter grupos.
2.4- Colagenase-1 (MMP-1)
As colagenases 1, 2 e 3, que correspondem respectivamente à MMP-1, MMP-8 e MMP-13, são as principais proteinases capazes de iniciar a degradação de vários colágenos fibrilares nativos, incluindo os colágenos tipo I, II, III e VII (STAMENKOVIC, 2000; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
A MMP-1 foi a primeira metaloproteinase humana a ser clonada, sendo considerada o protótipo para todas a colagenases intersticiais. Por ter sido obtida inicialmente a partir de fibroblastos de pele, ficou conhecida também como colagenase fibroblástica (PARDO, SELMAN, 2005). Esta metaloproteinase é a principal enzima responsável pela degradação do colágeno I (ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
De acordo com Brasileiro Filho (2004), o colágeno é a proteína mais abundante da matriz extracelular intersticial e, em mamíferos, o colágeno tipo I representa cerca de 90% do total destas proteínas fibrosas. Sua clivagem, portanto, é um evento essencial para que uma célula normal ou neoplásica possa se mover na matriz extracelular.
A proteólise do colágeno fibrilar resulta na produção de moléculas termicamente instáveis, que se desnaturam e assumem a forma de gelatina, que pode, então, ser
degradada por outros membros da família MMP (ZIOBER et al., 2000; PARDO, SELMAN, 2005).
Além dos colágenos fibrilares, a MMP-1 tem diversos substratos entre as moléculas da MEC, incluindo agrecan, nidogênio, perlecan e tenascina-C. A colagenase 1 também tem-se mostrado capaz de clivar moléculas da superfície celular e substratos não-matriz (PARDO, SELMAN, 2005).
A expressão de MMP-1 pode ser detectada em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos, embora em situações de normalidade, em tecidos adultos, seus níveis estejam usualmente baixos ou não detectáveis. Em cultura de células MMP- 1 é expressa por várias células normais, como queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais (LIN et al., 1997; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
Aumento na expressão de MMP-1 tem sido freqüentemente relatado em carcinomas epidermóides, muitas vezes em associação com pobre prognóstico (ZIOBER et al, 2000; FRANCHI et al, 2002; LIN et al, 2004; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
Objetivando examinar o papel das metaloproteinases em CCE oral, Ziober et al. (2000) investigaram a habilidade das células HSC-3, uma linhagem de células obtida de um carcinoma de células escamosas oral altamente invasivo, de degradar colágeno tipo I. Os autores observaram que inicialmente as células expressaram MMP-2 e MMP-9. Com a adição de EGF (fator de crescimento epidérmico), as células HSC-3 passaram a secretar também MMP-1 e tornaram-se capazes de degradar completamente colágeno tipo I. Além disso, foi demonstrado, por hibridização in situ, que MMP-1 não é expressa em mucosa normal, apenas minimamente expressa em displasia epitelial oral e carcinoma in situ e altamente expressa em CCE invasivo. Os autores concluíram que em carcinoma de células escamosas invasivo a MMP-1 é expressa in vivo, regulada positivamente por EGF e requerida para degradação do colágeno tipo I.
Em 2002, Franchi et al., investigando a expressão imuno-histoquímica de metaloproteinases em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço, evidenciaram moderada ou forte marcação para MMP-1 em 74,5% dos espécimes. Não foi detectada,
entretanto, nenhuma correlação significativa entre a expressão desta colagenase e outros indicadores de agressividade tumoral pesquisados, como marcadores de angiogênese e de proliferação celular.
Utilizando imuno-histoquímica, Miranda (2002) avaliou a expressão de proteínas da matriz extracelular em carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, com variada gradação histológica de malignidade. O autor constatou, na maior parte dos casos investigados, ausência ou fraca marcação para o colágeno I, substrato preferencial da MMP-1.
Lin et al. (2004) estudaram o DNA genômico do sangue de 121 pacientes portadores de carcinoma de células escamosas oral e observaram aumento do genótipo 2G no promotor da MMP-1 em maior freqüência que nos casos utilizados como controle. Os autores concluíram que a presença deste genótipo no promotor da MMP-1 está associada ao risco de desenvolvimento de carcinomas epidermóides, o que já foi verificado para carcinomas localizados em outras áreas do corpo.
2.5- Gelatinases (MMP-2 e MMP-9)
O grupo das gelatinases recebe esta denominação em função da sua capacidade de degradar colágeno desnaturado (gelatina) e é constituído por dois componentes: gelatinase-A (MMP-2) e gelatinase-B (MMP-9) (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; KUBOTA et al., 2000).
Estas enzimas são capazes de clivar colágeno IV, que é o principal constituinte da membrana basal, primeira barreira para a progressão de células epiteliais neoplásicas. Desta forma, as gelatinases desempenham um importante papel nos processos de invasão tumoral e metástase (HONG et al., 2000; LEV et al., 2002; ROBINSON et al., 2003; TSAI et al, 2003; RAUVALA, PUISTOLA, TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005). Além do colágeno IV e gelatina, as MMPs 2 e 9 têm outros substratos, que incluem: colágenos I, V e X e, para MMP-2, laminina (STAMENKOVIC, 2000).
A MMP-2 é geralmente expressa constitutivamente, particularmente em células estromais. A MMP-9, no entanto, é mais restrita e, em tecidos normais, exibe níveis tipicamente baixos ou está ausente, sendo induzida em condições que requerem remodelação tecidual (STAMENKOVIC, 2000; POLETTE et al., 2004).
As gelatinases parecem estar envolvidas no desenvolvimento de cistos e tumores odontogênicos, participando ativamente das interações entre as células epiteliais e os componentes mesenquimais (KUBOTA et al., 2000; KUMAMOTO et al., 2003; WAHIGREN et al., 2003).
Diversos trabalhos têm relatado aumento na imuno-expressão de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas orais ou de cabeça e pescoço (HONG et al., 2000; TOKUMARU et al., 2000; FRANCHI et al., 2002; KATAYAMA et al., 2004; KATO et al., 2005; LIU et al., 2005; TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005; VICENTE et al., 2005). De acordo com Dang et al. (2004), a MMP-9 é um importante modulador da matriz extracelular em carcinomas epidermóides orais.
Avaliando a imunorreatividade de proteínas da membrana basal em carcinoma epidermóides orais, Hirota, Yoneda, Osaki (1990) evidenciaram uma diminuição na expressão de colágeno IV, especialmente em estágios mais avançados, estando freqüentemente ausente em tumores com metástase linfonodal.
Hong et al. (2000) examinaram, através de imuno-histoquímica e zimografia, a expressão de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas de células escamosas orais com e sem metástase, a fim de avaliar a importância destas proteinases em predizer o potencial metastático das lesões estudadas. Eles observaram que ambas as metaloproteinases tiveram maior expressão no grupo metastático, mas esta diferença só foi significativa estatisticamente para a MMP-9, indicando, segundo os autores, que a produção de MMP-9 pelas células tumorais poderia ser um fator mais importante no processo de metástase linfática que a produção de MMP-2.
Tokumaru et al. (2000) estudaram a ativação de MMP-2 em amostras clínicas de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, bem como em uma linhagem de
células epiteliais malignas em co-cultura com fibroblastos. Eles observaram que a taxa de ativação da pro-MMP-2 foi significativamente mais alta em tecidos carcinomatosos que em tecidos normais e que esta taxa estava correlacionada significativamente com presença de metástase linfática. Além disso, os resultados obtidos in vitro sugeriram que os fibroblastos estromais produzem pro-MMP-2 e que a MMP-2 é ativada pelas células neoplásicas.
As MMPs- 2 e 9 foram avaliadas através de imuno-histoquímica por Franchi et al. (2002) em 43 casos de CCE de cabeça e pescoço, juntamente com a análise de MMP-1 e de vários outros fatores envolvidos no crescimento tumoral e metástase. Os autores não observaram correlação entre a expressão das MMPs estudadas e parâmetros clínicos, entretanto tumores com expressão aumentada de MMP-9 tiveram mais freqüentemente metástases linfáticas em comparação com os tumores com expressão baixa ou ausente. Além disso, este trabalho demonstrou correlação entre a expressão de MMP-9, ativação de óxido nítrico, taxa de p53 e angiogênese, nos casos estudados de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço.
Em carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, Miranda (2000) demonstrou ausência de expressão imuno-histoquímica de colágeno IV e laminina na membrana basal dos ninhos neoplásicos, em quase toda a amostra. Quando presente, esta marcação exibiu fraca intensidade e padrão delgado e descontínuo.
Em 2002, Papparella et al. examinaram a expressão imunohistoquímica de MMP-2 e MT1-MMP em uma série de 50 carcinomas mamários caninos. Este estudo revelou aumento na expressão destas metaloproteinases nos carcinomas estudados, entretanto, segundo os autores, pelo método imuno-histoquímico não foi possível relacionar tal expressão com a progressão da doença.
Robinson et al. (2003) examinaram por zimografia os níveis de MMP-2 e MMP- 9 em linhagens de células derivadas de carcinoma oral e em ceratinócitos normais. Além disso, avaliaram o comportamento celular através da observação da invasão e motilidade destas células in vitro e do transplante ortotópico das células tumorais para camundongos atímicos. Os autores encontraram correlação entre a expressão de ambas as gelatinases pelos ceratinócitos orais malignos e a invasão e motilidade exibidas por
estas células in vitro, entretanto nenhuma correlação foi observada com o potencial metastático in vivo.
Em 30 espécimes de carcinoma epidermóide oral e em uma linhagem de células derivadas de câncer oral, Tsai et al. (2003) verificaram que houve produção de MMP-2 e MMP-9 in vivo e in vitro e que a atividade das gelatinases foi regulada negativamente por inibidores da proteína-kinase – C (PKC).
Estudando 23 casos de CCE primários de língua, Guttman et al. (2004) avaliaram, por imuno-histoquímica, a expressão de MMP-9, TIMP-1 e os fatores angiogênicos CD-34 e fator-8, comparando-a com os aspectos clinicopatológicos das lesões. 60,9% dos espécimes exibiram imunopositividade, especialmente citoplasmática, para MMP-9, entretanto, nenhuma correlação estatisticamente significativa foi constatada entre a expressão de MMP-9 ou TIMP-1 e as características tumorais avaliadas: tamanho, metástase linfática e recorrência. Os autores concluíram que, dentre os marcadores examinados, apenas o grau de vascularização se relacionou com a agressividade da neoplasia.
Com o objetivo de investigar se a expressão de MMP-2 e MMP-9 tem valor predictivo para o curso clínico e prognóstico em estágios iniciais de carcinoma de células escamosas oral, Katayama et al. (2004) utilizaram o método imuno-histoquímico para avaliar a reatividade às gelatinases de 53 espécimes destas neoplasias. Seus resultados indicaram que houve significante correlação entre a expressão de MMP-9, mas não de MMP-2, com a ocorrência de metástase linfática ou à distância e pobre prognóstico.
Nagel et al. (2004) investigaram a expressão de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, 2 e 3 em 20 tumores malignos e 6 neoplasias benignas de glândulas salivares, por meio de imuno-histoquímica e zimografia. Foi evidenciado que a imunomarcação da MMP-2 foi significativamente mais alta em tumores malignos que em adenomas. Os autores constataram, ainda, que em carcinomas de glândulas salivares os desequilíbrios na proporção entre MMPs e TIMPs são causados pela regulação positiva de MMPs, mas não pela regulação negativa de TIMPs.
Em 2005, Kato et al. verificaram, por meio de zimografia e imuno-histoquímica, que MMP-2 e MMP-9 estão presentes em carcinomas epidermóides orais humanos nas formas de pro-enzima e ativada. Estas enzimas também foram detectadas em células estromais, o que levou os autores a sugerir que a interação entre células tumorais e estromais parece desempenhar um importante papel na invasão e metástase destas neoplasias.
Para investigar o valor prognóstico das MMPs 2 e 9, Liu et al. (2005) avaliaram a reatividade imuno-histoquímica destas gelatinases em 72 espécimes de CCE de laringe, comparando-as com as características clinicopatológicas e prognóstico. Seus resultados indicaram que há expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas de células escamosas de laringe, mas sem relação estatisticamente significante com os aspectos clínicos ou histológicos do tumor. O aumento na expressividade de MMP-2 exibiu, entretanto, relação significativa com pobre prognóstico nas lesões estudadas.
Com o objetivo de avaliar a relação das MMPs 2 e 9 com prognóstico, Vicente et al. (2005) estudaram a imunomarcação destas proteases em 68 carcinomas epidermóides orais. Destes, 28% expressaram MMP-2 e 17% foram positivos para MMP-9. Ambas as MMPs mostraram imunopositividade mais freqüentemente em pacientes com metástase linfática, embora esta diferença não tenha sido estatisticamente significante. A expressão imuno-histoquímica da MMP-9 exibiu associação significativa com o grau de diferenciação tumoral, estágio – T e com o consumo de álcool. Além disso, nos pacientes sem metástase linfática, a positividade para MMP-9 se relacionou com baixas taxas de sobrevida.
2.5- Matrilisinas (MMP-7 e MMP-26)
As matrilisinas são representadas por dois componentes: a MMP-7 e a MMP-26. Estas metaloproteinases possuem uma estrutura muito pequena, contendo apenas o mínimo necessário para secreção e atividade. Entretanto, são capazes de clivar uma
ampla variedade de substratos da matriz extracelular (LIU et al., 2002; YAMAMOTO et al., 2004).
A secreção de MMP-7 (matrilisina 1) tem sido descrita em células epiteliais, fibroblastos e macrófagos (WILSON, MATRISIAN, 1996), sendo expressa em processos normais, como cicatrização de feridas e ciclo endometrial (BAIR et al., 2001). A MMP-7 desempenha também um importante papel na manutenção da imunidade inata em órgãos, tais como pulmão e intestino, onde ativa proteoliticamente peptídeos anti-bacterianos, especialmente as pró-defensinas (BURKE, 2004).
Entre os substratos da MMP-7 podemos citar a fibronectina, gelatina, colágeno tipo IV, laminina e elastina (BAIR et al., 2001; BURKE, 2004). Além disso, a MMP-7 também é capaz de clivar os zimogênios das proteases MMP-2 e MMP-9, sendo importante na sua ativação (WILSON, MATRISIAN, 1996).
A MMP-7 tem sido detectada em células neoplásicas malignas de origem epitelial, onde parece desempenhar um papel ativo em virtualmente todos os estágios da progressão do câncer (WILSON, MATRISIAN, 1996; WIELOCKY, LIBERT, WILSON, 2004). De acordo com Sasaki et al. (2001), esta matrilisina constitui um bom marcador para a progressão tumoral.
A MMP-26 é a menor metaloproteinase conhecida atualmente, sendo também denominada endometase ou matrilisina-2 (PARK et al., 2003; AHOKAS et al., 2005). Ela foi identificada recentemente, tendo sido isolada simultaneamente por três grupos independentes (COIGNAC et al., 2000; PARK et al., 2000; URÍA, LOPÉZ-OTÍN, 2000).
Por possuir um mecanismo autolítico de ativação do zimogênio, a MMP-26 pode ser distinguida de todas as demais metaloproteinases (PARK et al., 2000; MARCHENKO et al., 2004).
A atividade proteolítica da MMP-26 contra vários componentes da MEC, incluindo fibronectina, colágeno IV, vitronectina, gelatina e fibrinogênio, sugere que esta matrilisina pode exercer uma importante função na progressão tumoral
(TUNUNGLA et al., 2003; YAMAMOTO et al., 2004; AHOKAS et al., 2005). Além disso, tem sido relatado que a MMP-26 é um ativador fisiológico e patológico de pró- MMP-9 (URÍA, LOPÉZ-OTÍN, 2000; AHOKAS et al., 2005).
A MMP-26 é freqüentemente expressa em tecidos adultos normais, como útero, placenta e rim, bem como em neoplasias malignas epiteliais de diferentes sítios