Metodologia Analítica

Os sedimentos foram secos em estufa a 40 ºC até não conter mais traços de umidade, sendo posteriormente desagregados com gral e pistilo de porcelana, homogenizados e armazenados até o momento da análise.

3.5.2. Procedimento analítico para determinação dos marcadores

moleculares

O sedimento seco (massa exata em torno de 15 g) recebeu 100 µL de uma

mistura de padrões de recuperação [nonadecilbenzeno (C19-LAB) e androstanol],

sendo posteriormente extraído em aparato Soxhlet durante 12 h com n-hexano e

diclorometano (1:1), seguindo metodologia da USEPA 3540C (USEPA, 1996). Para cada 12 amostras de sedimento extraídas, 1 era composto pelo branco, onde foi

utilizado sulfato de sódio (NaSO4) ao invés de sedimento, dessa forma foi avaliada a

recuperação do procedimento. Os extratos foram concentrados em evaporador rotatório, sendo tratados com cobre ativado para a retirada do enxofre presente na amostra e concentrados a 1 mL em evaporador rotatório e em fluxo de nitrogênio. Os extratos foram purificados e fracionados em três frações (F1, F2 e F3) por cromatografia de adsorção em coluna de alumina(topo)/sílica, sendo utilizado respectivamente 8 e 6g.

A F1 (primeira fração) foi eluída com 25 mL de n-hexano (para análise dos

LABs), a F2 (segunda fração) com 30 mL de uma proporção n-hexano/diclorometano

(3:1) e 25 mL de n-hexano/diclorometano (1:1) (para análise de HPAs), enquanto

que a F3 (terceira fração) foi retirada com 50 mL de diclorometano/metanol (3:1) (para análise dos esteróides e cafeína).

A determinação foi feita por cromatografia em fase gasosa com detector de espectrometria de massas (CG-EM). A identificação e quantificação dos compostos foram baseadas no espectro de massa individual e nos tempos de retenção comparados com a literatura, bibliotecas e padrões externos e internos.

A análise de esteróides foi realizada através de adaptação da metodologia descrita em Niencheski & Fillmann (2006), enquanto que da cafeína foi adaptada de

(2004), sendo todas otimizadas e validadas no Laboratório de Microcontaminantes Orgânicos e Ecotoxicologia aquática da FURG (CONECO).

3.5.3. Derivatização

Devido à baixa volatilidade e alta polaridade, a análise de esteróis por cromatografia de fase gasosa (CG) apresenta uma baixa eficiência. Uma forma de se aumentar à volatilidade dos esteróis, reduzir a polaridade e melhorar a resolução cromatográfica é o processo de derivatização. Neste processo os esteróis são convertidos a éteres trimetil-silícicos através da substituição do hidrogênio da hidroxila (-OH) da posição 3 dos esteróis pelo grupo trimetil-silícico (-Si(CH3)3) do reagente derivatizante N,O-bis(trimetil-silil-triflúor-acetamida/trimetil-cloro-silane)

(BSTFA/TMCS – 99:1, >99% de pureza, grau cromatográfico Aldrich^®),

possibilitando a resolução dos esteróis por cromatografia de fase gasosa (Figura 9).

A substituição do hidrogênio ativo por um grupo silil reduz a polaridade do composto

e diminui a força da ligação do hidrogênio (presente nos esteróis) existente com a

coluna cromatográfica que é formada por sílica. O grupo trimetilsilil é o mais popular

e versátil grupo silil utilizado para análises em cromatografia de fase gasosa. O uso do catalisador (TMCS) aumenta a reatividade do reagente silil. As estanonas e a cafeína também são submetidas a este processo, mesmo não sendo necessário, pois ambas são retiradas na mesma fração dos esteróis (F3), porém não sofrem nenhuma modificação que afete a sua detecção.

Figura 9 - Reação de derivatização dos esteróis (Martins, 2001)

A derivatização é feita levando a solução que contém os esteróides à secura,

sob o fluxo de nitrogênio (N2), posteriormente adicionando 40 µL do agente

derivatizante BSTFA:TMCS (99:1) à esta solução e aquecendo-a a 65 ºC em

banho-maria durante 1,5 h. A solução é novamente seca em fluxo de N2 e os compostos

recuperados com 1 mL de n-hexano.

3.5.4. Controle Analítico

O padrão interno (PI) é um composto adicionado à amostra que contém os analitos cujas massas pretendem-se determinar, antes que ela seja injetada, de forma que não interfira na análise. Para tal, ele nunca deve ser encontrado na amostra ambiental, estar disponível em elevado grau de pureza, ser adicionado à amostra em concentrações similares ao composto a ser analisado e ser bem resolvido dos outros picos. Este procedimento é extremamente útil, pois corrige variações de volume da injeção que poderia ocorrer (Lanças, 2004). Para o presente

trabalho o padrão interno utilizado foi o 5α-colestano (esteróides e cafeína) (Tabela

4).

O padrão externo (PE) é um composto certificado que é utilizado para a quantificação dos analitos em questão. Esse método compara a área da substância a ser quantificada na amostra com as áreas obtidas desta mesma substância em soluções padrão de concentrações conhecidas (Lanças, 2004). Os PEs utilizados no

presente trabalho foram: cafeína, decilbenzeno (1-C10-LAB), undecilbenzeno (1-C11

-LAB), dodecilbenzeno (1-C12-LAB), tridecilbenzeno (1-C13-LAB) e tetradecilbenzeno

β-sitosterol, colestanol, colesterol, ergosterol, estigmasterol, estigmastanol e coprostanona para os esteróides (Tabela 4).

Os fatores de resposta, juntamente com os tempos de retenção obtidos para cada um dos padrões externos, são agrupados gerando uma curva de calibração que é utilizada posteriormente na quantificação das amostras, determinando a concentração do analito (Lanças, 2004).

O padrão de recuperação é um composto adicionado logo no início do processo, em uma concentração conhecida, antes da extração, e é quantificado no final de todo procedimento para verificar quanto do analito adicionado foi determinado no método, ou seja, para verificar a recuperação do processo (Lanças, 2004). Os padrões de recuperação utilizados para o presente trabalho foram

nonadecilbenzeno (1-C19-LAB) para os LABs e androstanol para os esteróides e

para cafeína (Tabela 4).

Os critérios de controle de qualidade analítica para as metodologias padrão

utilizada no laboratório CONECO, contidas em Niencheski & Fillmann (2006), basearam-se na determinação dos limites de detecção e quantificação, análise de repetibilidade, tempos de retenção, avaliação do desempenho e sensibilidade do equipamento, construção de curvas analíticas, materiais fortificados, brancos

analíticos e calibração de vidrarias (Lanças, 2004; Ribani et al., 2004; INMETRO,

Tabela 4: Compostos utilizados no preparo dos padrões externo, interno e de recuperação, bem como o fornecedor do padrão, grau de pureza, código do lote e validade do padrão

Composto Padrão Fornecedor Grau de Pureza ^Código _{do lote} Validade

Decilbenzeno (LAB 10) Externo Fluka ≥99,5% (CG) 78366 2009

Undecilbezeno (LAB 11) Externo Aldrich 99% 113220 2011

Dodecilbenzeno (LAB 12) Externo Fluka ≥99,5% (CG) 44178 2009

Tridecilbenzeno (LAB 13) Externo Fluka ≥99,5% (CG) 91598 2009

Tetradecilbenzeno (LAB 14) Externo Fluka ≥99,5% (CG) 87204 2010

Nonadecilbenzeno (LAB 19) Recuperação Fluka ≥99,5% (CG) 74238 2009

Cafeína Externo Sigma Aldrich - C1778 2012

5α-colestano Interno Fluka ≥96.0% (CG) 26700 2012

Androstanol Recuperação Sigma - 48168 2009

Coprostanol Externo Sigma ≥98% C7578 2012

Epicoprostanol Externo Sigma ≥95% C2882 2012

Colesterol Externo Fluka ≥99.0% (CG) 26732 2010

Colestanol Externo Fluka ≥90% (CG) 26710 2012

Coprostanona Externo Sigma - C2152 2012

Colestanona Externo Sigma - C8128 2012

Ergosterol Externo Sigma ≥95% 45480 2010

β-sitosterol Externo Sigma ≥97.0% (CG) S9889 2008

Campesterol Externo Sigma ~65% C5157 2008

Estigmasterol Externo Sigma ~95% S2424 2012

Estigmastanol Externo Sigma ≥95% S4297 2012