5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
6. TESTES MICROBIOLÓGICOS
6.2 METODOLOGIA APLICADA NOS TESTES MICROBIOLÓGICOS
De acordo com RAUHA et al. (2000) o teste antimicrobiano foi feito empregando-se caldo de cultura com 24 horas de incubação. A densidade ótica foi determinada a 625 nm. O cultivo foi encerrado quando a absorbância atingiu o valor de 0,8 a 1,0, diluído a uma absorbância de 0,1 e utilizado para os testes antimicrobianos.
O meio consiste de duas camadas, a superior somente apresentando o inoculado. Ágar (30 mL) foi deitado em uma placa de Petri (diâmetro de 14 cm).
O ágar foi deixado para geleificar e depois 30 mL de ágar Isosensitest (bactérias) ou ágar Sabouraud (fungos) incubado foi deitado na parte superior.
O ágar Isosensitest consiste de 24,2 µL de suspensão bacteriana em 30 mL e o ágar Sabouraud com 250 µL de suspensão fúngica em 30 mL.
O teste antimicrobiano foi realizado de 2 formas: pelo método de difusão em placa furada e pelo método da difusão cilíndrica.
O método de difusão em placa furada se resume em conferir seis furos eqüidistantes no ágar utilizando um perfurador de rolhas esterilizado (n° 9, diâmetro de 14 mm). Um volume de 500 µL de amostra em solução metanólica (1 mg/mL) foi adicionado aos furos usando um pipetador.
O método da difusão cilíndrica consiste em realizar seis cilindros eqüidistantes arranjados sobre a superfície do ágar. Amostras de 500 µL do extrato metanólico (1 mg/mL, metanol) foi adicionado aos cilindros usando um
pipetador. As placas para o teste com as cepas bacterianas foram incubadas a 23 °C por 1 hora para facilitar a difusão e então incubadas a 35 °C por 24 horas. As placas para o teste com fungos foram refrigeradas a 8 °C por 1 hora e então incubadas a 25 °C por 72 horas, exceto o Aspergillus niger que foi incubado a 25 °C por 6 dias.
A avaliação final se dá através da medida do diâmetro da zona de inibição. Depois da incubação as zonas de inibição foram medidas com uma acuidade de 0,1 mm, e o efeito foi calculado como a média de testes em triplicata.
No trabalho de PUUPPONEN-PIMIÃ et al. (2001) pode-se verificar que dois métodos foram utilizados para investigar os efeitos antimicrobianos de compostos fenólicos: o método de difusão no ágar com camada de “soft ágar” e determinação da curva de crescimento bacteriano a partir do crescimento microbiano numa cultura líquida. Para o método de difusão no ágar, todos os reagentes e extratos foram dissolvidos no metanol. Extratos liofilizados foram utilizados para os experimentos com cultura líquida.
Para o método de difusão no ágar, foi utilizado “soft ágar”, contendo 4,5 mg/mL de Bacto-ágar em meio líquido de crescimento. Após autoclavado, foi resfriado até 42 °C e inoculado com líquido de uma cultura pré-cultivada na concentração de células de 5 x 105 UFC/ mL e as placas contendo 20 mL de meio ágar foram cobertas com 5 mL deste inoculado de “soft ágar”. Depois de definido o tamanho dos furos (7 mm em diâmetro) no ágar, as placas foram mantidas a temperatura ambiente por 30 minutos e então a 4 °C por 2,5 horas permitindo que o líquido ficasse bem firme. Os compostos fenólicos puros e os extratos de berries, em diferentes concentrações, foram dissolvidas em metanol e pipetados no ágar geleificado (50 µL). Estreptomicina (150 e 600 µg em 50 µL) foi utilizado como controle positivo (controle de resistência de antibiótico) para todas as outras cepas (vide item 6.1 deste capítulo). Um controle negativo foi utilizado empregando-se metanol (50 µL). O diâmetro de inibição foi medido em 24 e 48 horas. Todos os testes foram feitos em triplicata.
Nos experimentos em cultura líquida, 10 mL de meio de cultura fresco foram inoculados com 1 a 5% de cultura pré-cultivada. Os extratos das berries
liofilizadas ou os compostos fenólicos puros foram adicionados ao meio de cultura resultando em uma concentração final de 0,5, 1,0 ou 5,0 mg/mL. As culturas foram homogeneizadas e incubadas como descrito a seguir. Do caldo bacteriano inoculado foram coletadas amostras 5 a 6 vezes durante um período de incubação de 9 a 34 horas, dependendo da taxa de crescimento da cepa.
As amostras foram diluídas em água peptonada e as próprias diluições colocadas em placas. As placas foram incubadas e a contagem microbiana procedida. Os efeitos inibitórios do teste com compostos sobre as bactérias foram medidos comparando as curvas de crescimento controle com as obtidas com extratos de berries ou compostos fenólicos puros.
Para analisar a atividade antimicrobiana de extrato de goiaba, CARVALHO et al. (2002) utilizaram o teste de atividade antimicrobiana através do método de difusão em disco de papel (tipo 3 com 6 mm de diâmetro) no meio gelosado Müller Hinton. As suspensões dos microrganismos-teste foram semeadas na superfície do meio, em placas de Petri, com o auxílio de alça de Drigalsky (100 µL/placa). Foram utilizados discos de 6 mm de diâmetro, embebidos com 20 µL de uma solução a 100 mg/mL dos extratos em estudo.
As placas foram incubadas a 35°C durante 24 horas. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mm pela média aritmética do diâmetro dos halos de inibição formado ao redor dos discos nas 3 repetições. O teste controle foi realizado também com os discos embebidos com o agente diluente dos extratos.
Em VARGAS et al. (2004) o teste microbiológico de sensibilidade, foi realizado utilizando-se uma alça de Drigalski para a semeadura de 0,1 mL da suspensão bacteriana contendo aproximadamente 1 x 106 bactérias/mL por placa, realizando-se duas repetições por tratamento. As placas foram incubadas a 37°C por 24 a 72 horas, dependendo da espécie bacteriana testada. Os isolados foram considerados sensíveis ao extrato de própolis, quando não ocorreu crescimento bacteriano nas placas após 72 horas de incubação a 37°C.
REFERÊNCIAS
AL-SAIKLON, M.S.; HOWARD, L.R.; MILLER, J.C. Antioxidant activity and total phenolics in different genotypes of potato (Solanum tuberosum). Journal of Food Science. Chicago, v. 60, n. 2, p. 341-343, 1995.
BENDINI, A.; TOSCHI, T.G.; LERCKER, G. Antioxidant activity of oregano (Origanum vulgare L.) leaves. Italian Journal of Food Science. Pinerolo, v.
14, n. 1, p. 17-24, 2002.
BIRCH, A.E., FENNER, G.P.; WATKINS, R.; BOYD, L.C. Antioxidant proprieties of evening primrose seed extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v.49, p. 4502-4507, 2001.
BURNS, J.; GARDNER, P.T.; MATTHEWS, D.; DUTHIE, G.G.; LEAN, M.E.J.;
CROZIER, A. Extraction of phenolics and changes in antioxidant activity of red wines during vinification. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v.49, p. 5797-5808, 2001.
CALIXETO, F. S. Antioxidant dietary fiber product: a new concept and a potencial food ingredient. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v. 46, p. 4303-4306, 1998.
CAO, G.; ALESSIO, H. M.; CUTLER, R. G. Oxygen-radical absorbance
capacity assay for antioxidants. Free Radical Biology and Medicine. Oxford, v. 14, p. 303-311, 1993.
CAO, G.; SOFIC, E.; PRIOR, R. L. Antioxidant capacity of tea and common vegetables. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 44, p.
3425-3431, 1996.
CARVALHO, A.A.T.; SAMPAIO, M.C.C.; SAMPAIO, F.C.; MELO, A.F.M.;
SENA, K.X.F.R.; CHIAPPETA, A.A.; HIGINO, J.S. Atividade antimicrobiana in vitro de extratos hidroalcoólicos de Psidium guajava L. sobre bactérias Gram-negativas. Acta Farmacéutica Bonaerense. Buenos Aires, v.41, n.4, p. 255-8, 2002.
CHU, Y. H.; CHANG, C. L.; HSU, H. F. Flavonoid content of several vegetables and their antioxidant activity. Journal of Science of Food and Agriculture.
Chicago, v. 80, p. 561-566, 2000.
CORDENUNSI, B.R.; NASCIMENTO, J.R.O.; GENOVESE, M.I.; LAJOLO, F.M.
Influence of cultivar on quality parameters and chemical composition of strawberry fruits grown in Brazil. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 50, n. 9, p. 2581-2586, 2002.
DEIGTHON, N.; BRENNAN, R.: FINN, C.; DAVIES, V.H. Antioxidant
proprieties of domesticated and wild Rubus species. Journal of Science of Food and Agriculture. Chicago, v. 80, p. 1307-1313, 2000.
EVANGELISTA, J. Tecnologia de Alimentos. Rio de Janeiro: Atheneu, 1987.
FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de alimentos. São Paulo: Atheneu, p. 43-46, 1996.
GENOVESE, M.I.; SANTOS, R.J.; HASSIMOTTO, N.M.A.; LAJOLO, F.M.
Determinação do conteúdo de fenólicos totais em frutas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. São Paulo, v 39, n. 3, p.167-169, 2003.
GIL, M. I.; TOMAS-BARBERAN, F.A.; HESS-PIERCE, B.; HOLEROFT, D.M.;
KADER, A.A. Antioxidant activity of pomegranate juice and its relacionship with phenolic composition and processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 48, p. 4581-4589, 2000.
HEINONEN, I. M.; LEHTONEN, P. J.; HOPIA, A. I. Antioxidant activity of berry and fruit wines and liquors. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v. 46, p. 25-31, 1998.
JUSTESEN, U.; KNUTHSEN, P.; LETH, T. Quantitative analyses of flavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables and beverages by high
performance liquid chromatography with photodiode array and mass
spectrometric detection. Journal of Chromatography. Amsterdan, n. 799, p.
101-110, 1998.
KÄHKÖNEN, M. P.; HOPIA, A. I.; VUORELA, H. J.; RAUHA, J.P.; PIHLAJA, K.;
KUJALA, T.S.; HEINONEN, M. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 47, p. 3954-3962, 1999.
KÄHKÖNEN, M.P.; HOPIA A.I.; HEINONEN, M. Berry phenolics and their antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v.49, p. 4076-4082, 2001.
KUBO, I.; FUGITA, K. Naturally occuring anti-Salmonella agents. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 49, p. 5750-5754, 2001.
LARRAURI, J. A.; GOÑI, I.; MARTÍN-CARRÓN, N.; RUPÉREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F. Measurement of health promoting properties in fruit dietary fibres:
Antioxidant capacity, fermentability and glucose retardation index. Journal of Science of Food and Agriculture. Chicago, v. 71, p. 515-519, 1996.
LAVELLI, V.; PERI, C.; RIZZOLO, A. Antioxidant activity of tomato products as studied by model reactions using xanthine oxidase, myeloperoxidase, and copper-induced lipid peroxidation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Chicago, v. 48, p. 1442-1448, 2000.
LEITE, J.P.V.; RASTRELLI, L.; ROMUSSI, G.; OLIVEIRA, A.B.; VILEGAS, J.H.Y.; VILEGAS, W.; PIZZA, C. Isolation and HPLC quantitative analyses of flavonoid glycosides from brazilian bevereges (Maytenus ilicifolia and M.
aquifolium). Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v.49, n. 6, p. 3796-3801, 2001.
MARCO, G. J. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of American Oil Chemistry Society. Chicago, v. 45, p. 594-598, 1968.
MIEAN, K.H.; MOHAMED, S. Flavonoid (myricetin, quercetin, kaempferol, luteolina, and apigenin) content of edible trpopical plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 49, p.3106-3112, 2001.
MILLER, H. E. A simplified method for the evaluation of antioxidant. Journal of American Oil Chemistry Society. Chicago, v. 48, p. 91, 1971.
MIYAKE, T.; SHIBAMOTO, T. Antioxidante activities of natural compounds found in plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Chicago, n. 45, p. 1819-1822, 1997.
PELCZAR, J.M.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia – Conceitos e Aplicações. 2.ed. São Paulo: Makron Books, v.1, cap.8, p.166-174; 211-223, 1996.
PUUPPONEN-PIMIÄ, R.; NOHYNEK, L.; MEIER, C.; HÄHKÖNEN, M.;
HEINONEN, M.; OKSMAN-CALDENTEY, K.M. Antimicrobial properties of phenolic compouds from berries. Journal of Applied Microbiology. Oxford, v.
90, p. 494-507, 2001.
RAUHA, J.P.; REMES, S.; HEINONEN, M.; HOPIA, A.; KÄHKÖNEN, M.;
KUJALA, K.; PIHLAJA, K.; VUORELA, H.; VUORELA, P. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds.
International Journal of Food Microbiology. Amsterdam, v. 56, n.1, p. 3-12, 2000.
SILVA, E. A. Manual de controle higiênico-sanitário de alimentos. São Paulo: Varela. 1997.
SILVA, N. ; SILVEIRA, N.F.A.; YOKOYA, F.; OKAZAKI, M.M. Ocorrência de Escherichia coli O157:H7 em vegetais e resistência aos agentes de
desinfecção de verduras. Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas, v.
23, n. 2, p. 167-173, 2003.
SLUIS, A.A.; DEKKER, M.; JAGER, A.; JONGEN, W.M.F. Activity and
concentration of polyphenolic antioxidants in apple: effect of cultivar, harvest year, and storage conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v.49, p. 3606-3613, 2001.
SU, Y.L.; LEUNG, L.K.; BI, Y.R.; HUANG, Y.; CHEN, Z.Y. Antioxidant activity of flavonoids isoleted from Scutellaria rehderiana. Journal of American Oil Chemistry Society. Chicago, v. 77, n.8, p. 807-812, 2000.
TOMÁS-BARBERÁN, F.A.; GIL, M.I.; CREMIN, P.; WATERHOUSE, A.L.;
PIERCE, B.H.; KADER, A.A. HPLC-DAD-ESIMS analysis of phenolic compounds in nectarines, peaches, na plums. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v.49, p. 4748-4760, 2001.
VARGAS, A.C.; LOGUERCIO, A.P.; WITT, N.M.; COSTA, M. M.; SILVA, M.S.;
VIANA, L.R. Atividade antimicrobiana “in vitro” de extrato alcoólico de própolis.
Ciência Rural: Santa Maria, v. 34, n. 1, p. 1-8, 2004.
VINSON, J.A.; HAO, Y.; SU, X.; ZUBIK, L. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: vegetables. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v.46, p. 3630-3634, 1998.
VINSON, J.A.; SU, X.; ZUBIK, L.; BOSE, P. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v.49, p. 5315-5321, 2001.
WANG, H. CAO, G. H.; PRIOR, R. L. Total antioxidant capacity of fruits.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 44, p. 701-705, 1996.
WANG, H.; CAO, G.; PRIOR, R. L. Oxygen radical absorbing capacity of anthocyanin. Journal of Agricutural and Food Chemistry. Chicago, v. 45, p.
304-309, 1997.
WANG, S.Y.; ZHENG, W. Effect of plant growth temperature on antioxidant capacity in strawberry. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v. 49, p. 4977-4982, 2001.
WATANABE, M. J. Catechins as antioxidants from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moech). Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 46, n. 3, p. 839-845, 1998.
YEN, G. C.; CHEN, H. Y. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Chicago, v. 43, p. 27-32, 1995.
YILDIRIM, A.; MAVI, A.; KARA, A.A. Determination of antioxidant and
antimicrobial activities of Rumex crispus L. extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 49, p. 4083-4089, 2001.
ZHENG, W.; WANG, S.Y. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 49, p. 5165-5170, 2001.
ZIELISKI, H.; KOZOWSKA, H. Antioxidant activity and total phenolics in selected cereal grains and their different morphological fractions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Chicago, v. 48, p. 2008-2016, 2000.
CAPÍTULO V