1. Delineamento experimental.
Unidades experimentais: 84 blocos de dentes bovinos. Fatores em estudo:
Tratamento clareador/espessante (7 níveis):
Peróxido de Carbamida 10% / Carbopol - FGM - Whiteness Perfect ® Peróxido de Carbamida 10% /Aristoflex𝑧 ® - Gel experimental - manipulado Peróxido de Carbamida 10% / Carbopol - Gel manipulado
Espessante Carbopol Espessante Aristoflex® Peróxido de Carbamida 10% Sem tratamento
Variáveis de resposta:
- Cor (∆L, ∆a, ∆b, ∆E) - Perfilometria (Ra)
- Microdureza Knoop (KHN)
- Análise analítica de quantificação do mineral Ca e P (espectrômetria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente - ICP OES)
Forma de designar o tratamento às unidades experimentais: por processo aleatório, através de sorteio.
2. Preparo dos espécimes.
Incisivos bovinos foram extraídos e armazenados em solução aquosa de timol 0,1% (Dinâmica, Piracicaba, São Paulo, Brasil) e em seguida os debris foram removidos com lâminas de bisturi e os dentes polidos com taça de borracha e pedra-pomes (SS White LTDA; Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e água. Após este procedimento, os dentes foram armazenados em água destilada. Foi realizada a separação da coroa da porção radicular com disco de diamante dupla face (KG Sorensen, Ind. Com. Ltda, Barueri, SP, Brasil) sob constante irrigação de jato de água, em micromotor de baixa rotação (Dabi Atlante; Ribeirão Preto, SP, Brasil) (Figura 1).
Em seguida, foram feitos outros cortes na porção coronária, dois sentidos mésio- distal e dois no sentido inciso-cervical em cortadeira metalográfica (Isomet 1000, Buehler), com disco diamantado (4” × 012 × 1⁄2, Buehler, Illinois, USA) para a obtenção dos fragmentos com área de superfície de 16mm2 (fragmentos de 4x4 mm, aproximadamente, e 2,5 mm de altura), sendo 1 mm de espessura de esmalte (Figura 2).
Cada fragmento teve a superfície de esmalte tratada com lixas de carbeto de silício (Sic), de granulação #600 e #2500 e #4000 (Buehler, Lake Bluff, IL, USA) sob irrigação constante, utilizando-se politriz giratória (Arotec Ind. Com., Cotia, SP, Brasil) para planificar a superfície. Por fim, a superfície de esmalte foi polida com feltros (TOP, RAM e SUPRA – Arotec, Cotia; SP, Brasil), associados à soluções sprays contendo diamante suspenso em diferentes granulações (3, 1/4 e 0,25µm). Entre cada aplicação de lixa e feltro e ao final do polimento, as amostras foram levadas à cuba de ultrassom (Marconi, Piracicaba, São Paulo, SP, Brasil), durante 15 minutos, para remoção de debris presentes na superfície de esmalte (Figura 3). Ao final, as amostras foram sonicadas com solução de limpeza
a)
b)
c)
d) e)
Figura 3. Planificação e polimento da superfície de esmalte. a) Lixas de carbeto de silício; b) sprays contendo diamante suspenso e discos de feltro; c) Politriz giratória; d) cuba de ultrassom; e) solução de limpeza.
c) d)
Figura 2. Cortes para obtenção dos espécimes. a) Cortadeira metalográfica; b) Espécime posicionado para ser cortado pelo disco; c) Coroa posicionada antes dos cortes; d) Coroa posicionada após os cortes evidenciando a obtenção do espécime.
(UltraMet TM 2 Sonic Cleaning Solution - Buehler, Lake Bluff, IL, USA) para remoção do excesso do material de polimento. Os espécimes ficaram padronizados e com o esmalte liso e brilhante (Figura 4).
Durante a confecção das amostras, as espessuras de esmalte e dentina foram mensuradas com paquímetro digital, e as amostras que não possuíam espessura adequada foram descartadas. Além disso, também foram descartadas amostras com trincas e manchamentos. Por ser uma padronização trabalhosa, um grande número de dentes foi utilizado para a obtenção de 84 blocos (Figura 4).
Todos os espécimes receberam uma marcação na lateral com ponta diamantada esférica #1014 (KG) para padronizar as leituras das propriedades físicas como a cor, rugosidade e microdureza (inicias e finais) sempre na mesma posição (Figura 5).
a) b)
Figura 4. Espécimes finalizados. a) Bloco de esmalte e dentina ( 4 x 4 x 2,5 mm); b) Amostras padronizadas.
a) b)
Figura 5. Padronização das amostras. a) realização da marcação; b) espécime padronizado e finalizado.
Os espécimes foram, aleatoriamente, divididos em 7 grupos de acordo com o tratamento de clareamento/espessante (Tabela 1). Um fluxograma do esudo é apresentado na figura 6.
Tabela 1: Distribuição dos grupos experimentais de acordo com o tratamento. Grupos Tratamento clareador/espessante
WP Peróxido de Carbamida 10% ( Carbopol)- FGM -
Whiteness Perfect
A+CP 10% Peróxido de Carbamida 10% (Aristoflex) – Gel experimental – manipulado
C+CP 10% Peróxido de Carbamida 10% (Carbopol) – Gel experimental – manipulado
A Espessante Aristoflex
C Espessante Carbopol
CP 10% Peróxido de Carbamida 10%
3. Protocolo de manchamento.
O manchamento das amostras foi realizado com solução de chá que foi produzida misturando 1,8g do chá preto (Dr. Oetker LTDA, São Paulo, SP, Brasil) em 100 ml de água destilada fervida por 3 minutos e em infusão por 5 minutos, onde os fragmentos dentais foram imersos. A infusão foi trocada a cada 24 horas, durante 6 dias (Figura 7a). Após esse período de imersão na solução, as amostras foram armazenadas em saliva artificial (composição: 1,5 mM de Cloreto de cálcio, 0,9 mM de fosfato de sódio, 150 mM cloreto de potássio, 0,1 M de tampão Tris) em estufa a 37ºC (± 1ºC) (Queiroz et al., 2008, Zeczkowski M et al., 2015), por 1 semana, sendo trocada diariamente para estabilização da cor (Serra, et al., 1992). Antes da realização da leitura pelo espectrofotômetro, a borra de chá preto formada sobre o esmalte e a dentina foi removida através do uso de uma taça de borracha com uma
Figura 6. Fluxograma experimental do estudo. a) Dentes selecionados após
desinfecção; b) porção coronária após a separação da porção radicular; c) representação dos cortes realizados na porção coronária; d) bloco de esmalte e dentina - amostra finalizada; e) análise de cor inicial; f) análise da rugosidade de superfície inicial; g) análise de microdureza knoop para a blocagem; h) tratamento clareador/espessante; i) análise de cor final; j) análise da rugosidade de superfície final; l) análise de microdureza knoop m) análise da reologia nos géis clareadores/espessantes.
mistura de pedra pomes de granulação ultra fina e água (proporção 2:1), em baixa rotação por 30 segundos em cada face, por um único operador (Lima, et al., 2008). As amostras, novamente, foram submetidas ao polimento com a lixa de carbeto de silício (SiC), de granulação #4000 sob irrigação constante de água, em politriz giratória para a obtenção de uma superfície lisa e polida (Figura 7b).
4. Preparo dos géis.
O gel espessante foi preparado com 0,2g de cada polímero na concetração de 2% (carbopol e Aristoflex®), adicionado à mistura de 0,1g de nipagin, concentração 1%, e 9g de água deionizada. Para finalizar, foi adicionado à mistura 0,79g do umectante propilenoglicol 7% (Figura 8a).
Os géis clareadores experimentais foram confeccionados com 8,68g do gel espessante (carbopol e Aristoflex), preparado anteriormente, a qual foi adicionado à uma mistura de 1g de cristais de peróxido de carbamida 10% (Figura 8c), 0,02g de fluoreto de sódio, na concentração de 0,2% e 0,03g de nitrato de potássio à 3% (Figura 8b). Toda homogeneização foi realizada manualmente, até que obtivesse ao final um gel trasnlúcido e bem viscoso (Figura 8d).
a) b)
Figura 7. Manchamento das amostras: a) amostras imersas na solução de chá preto; b) amostras manchadas.
O pH dos géis clareadores/espessantes foram mensurados em duplicata utilizando um pH-metro digital, com aproximadamente 3g de cada gel (Figura 09).
a) b)
c) d)
Figura 8. Produtos utilizados na confecção dos géis. a) polímero, nipagin, propilenoglicol; b) fluoreto de sódio; nitrato de potássio; cristais de peróxido de carbamida; c) adição do peróxido de carbamida 10%, note-se o estado cristalino do composto; d)gel clareador experimental formado.
Figura 9. Mensuração do pH no fim da fabricação dos géis.
5. Protocolo de aplicação do tratamento clareador/espessante
Previamente ao tratamento clareador, anteparos foram confeccionados a base de resina acrílica na proporção de 2:1 e no centro deste foi colocado um bloco de silicone de adição (Elite HD + normal setting-© Zermack SpA- Badia Polesine (RO), Italy) nas dimensões de 5x5mm para criar o espaço de acomodação do espécime (Figura 10 a). Após a polimerização da resina, o bloco foi removido e o espécime foi posicionado com auxílio de cera (Cera pegajosa em bastão ASFER Indst. Química Ltda, São Caetano do Sul, São Paulo, SP, Brasil), deixando somente a superfície do esmalte dental exposta (Figura 10 b e c). Para evitar o escoamento do peróxido de hidrogênio a 10% sem espessante. As amostras tiveram que ser posicionadas 1mm aquém do anteparo. Todos os anteparo foram fixados com fio de aço inoxidável em recipientes plásticos individuais, com a finalidade de facilitar o manuseio e evitar a contaminação do espécime (Figura 10 d).
Os espécimes receberam o tratamento clareador e espessante conforme descrito na Tabela 1. O grupo sem tratamento foi armazenado em solução de saliva artificial (pH=7,0) em estufa a 37ºC (± 1ºC), com trocas diárias durante todo o tratamento (Figura 11a).
O tratamento clareador foi realizado durante 14 dias consecutivos. Os géis foram individualmente pesados e padronizados sobre cada amostra em balança analítica (Shimadzu AUW 220 d, Quioto, Japão), até atingir um peso, de aproximadamente, 0,01g (Cavalli et al., 2010) ( Figura 11 b e c). Esse gel permaneceu por 4 horas sobre a superfície do
a)
b)
c) d)
Figura 10. Preparo dos anteparos para manuseio das amostras. a) anteparos de resina acrílica; b) remoção do bloco de silicone; c) inserção do espécime no anteparo; d) anteparo finalizado.
espécime, reservados em recipientes hermeticamente fechados em estufa e umidade relativa a 37 oC ± 2, simulando a cavidade oral.
Após o tempo de clareamento de 4 horas, o gel foi removido com o auxílio de um com hastes flexíveis de plástico com algodão em suas pontas (Cotonetes- Johnson & Johnson, Brasil). Ao final, as amostras foram lavadas por 1 minuto, com água deionizada (com exceção dos dias 10, 30, 70 e 140), secadas com papel absorvente (Kleenex – Kimberly- Clark, Brasil) e armazenadas em 3,0ml de solução de saliva artificial (pH=7,0) em estufa a 37ºC (± 2ºC) (Figura 12).
a) b) c)
d) e)
Figura 11. Tratamento clareador. a) Géis clareadores identificados por cor, pois o estudo foi cegado; b) pesagem incial (tarando a balança); c) pesagem final do gel para cada amostra em cada dia do tratamento clareador; d) amostras distribuídas no pote plástico umedecido com algodão; e) pote fechado acomodando as amostra na estufa durante o tempo do clareamento.
a) b) c)
Figura 12. Remoção do gel clareador: a) Remoção do gel com hastes flexíveis de plástico com algodão; b) Lavagem com a água deionizada por 1 minuto; c) secadas com papel absorvente ultra macio.
6. Coleta da solução de enxágue
No 10, 30, 70 e 140 dia o gel de todas a amostras (n=12) de cada grupo foi cuidadosamente removido por meio da lavagem com 3mL de água deionizada em um recipiente (Figura 13 a). Em seguida, cada recipiente foi sonicado em banho de ultrassom (Marconi, Piracicaba, São Paulo, SP, Brasil) durante 1 minuto e levadas ao agitador de tubos (Agitador de soluções AP56, Phoenix Luferco, Araraquara, SP, Brasil) por também 1 minuto, para melhor separação do gel da superfície do esmalte e homogeneização da solução de enxágue (metodologia baseada e modificada dos estudos de Cavalli et al., 2012 e Vieira- Junior et al., 2018) (Figura 13 b, c e d).
Após sonicar e agitar os espécimes, os mesmos foram removidos da solução de enxágue e recolocados em recipientes individuais contendo 3,0mL de saliva artificial. A solução desse enxágue foi coletada e armazenada em temperatura controlada (–18ºC± 2oC) para posterior análise das concentrações de cálcio (Ca +2) e fósforo inorgânico (P) por meio da espectrômetria de emissão óptica com plasma ICP OES (ICap 7400 Duo, Thermo Scientific) (Figura 14).
Figura 13. Coleta do gel. a) Lavagem com água deionizada por 1ml; b) armazenamento em pote hermeticamente fechado; c) Amostras durante a sonicação; d) Votex, usado para homogeneizar a solução de enxague.
a)
b)
b)
7. Determinação da Cor
As análises de cor foram realizadas antes e após os tratamentos clareadores/espessantes somente na superfície de esmalte. As amostras foram removidas da base de resina acrílica e, em seguida, colocadas em um dispositivo de teflon (porta amostra)(Figura 15 a). Em seguida, as leituras da cor foram realizadas dentro de uma Câmara de luz (GTI Mini Matcher MM1e, GTI Graphic Technology Inc., Newburgh, NY, USA) para padronização do ambiente de cada leitura (Figura 15b). Foi utilizado um espectrofotômetro Konica Minolta CM-700d previamente calibrado de acordo com as instruções do fabricante (Figura 15 c).
a) b) c)
Figura 15. Avaliação da cor: a) espécime posicionado no porta amostra; b) câmera de luz usada para padronização da luz no momento da leitura; c) Espectrofotômetro.
Figura 14. Coleta e armazenamento da solução de enxágue.
8. Determinação do perfil de superfície.
A análise de rugosidade de superfície foi avaliada através do perfilômetro (DEKTAK 150 - Veeco, NY, USA) (Figura 16 a). Foram realizadas três varreduras, em diferentes posições, em toda superfície do espécime por meio de uma ponta metálica com diâmetro de 12,5µm (Figura 16 b). Cada varredura gerou um perfil de altura em função da largura percorrida em 500µm de comprimento, com carga de 1,0mg e duração de 25s (Figura 16 c). Assim, a média dos valores de rugosidade média (Ra) das três varreduras foi considerada como a rugosidade de cada amostra. Os dados foram processados no softwere Dektak version 9.2.
9. Determinação da microdureza Knoop.
A análise de microdureza knoop foi realizada antes e após todos os tratamentos (clareador/espessante). Foi utilizado microdurômetro (HMV-2T E, Shimadzu Corporation, Tóquio, Japão) com indentador de diamante Knoop sob carga de 25g, por 5 segundos, sobre a superfície de esmalte em cada amostra ( Figura 17). Cinco medições Knoop foram realizadas: uma no centro e outras quatro a uma distância de 100 mM a partir da localização central. A média dos 5 valores das indentações foi calculada como o valor de KHN para cada espécime.
a) b) c)
Figura 16. Avaliação do perfil da superfície: a) Perfilômetro; b) Visão aproximada da ponta metálica do perfilômetro sobre a amostra, no momento da leitura; c) Tela do computador acoplada ao perfilômetro, mostrando o perfil da amostra.
10. Determinação da concentração de cálcio e fósforo na solução de enxágue.
Para a quantificação dos elementos químicos Ca e P foi utilizado espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente - ICP OES (ICap 7400 Duo, Thermo Scientific) (Figura 18 a).
Nesta técnica, a amostra líquida é dispersa em uma fase gasosa (em geral o argônio) com o emprego de um nebulizador, formando gotículas. Essas gotículas são
Shimadzu HMV-
a) b)
c)
Figura 17. Análise de microdureza: a) Microdurômetro; b) Iluminação na amostra para escolha da região de leitura; c) momento da indentação na superfície da amostra.
Figura 18. Análise química das soluções de enxágue: a) espectrômetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente; b) amostras líquidas são sugadas para o interior do equipamento; c) região de nebulização e formação dos microcristais (círculo azul), região do plasma (círculo vermelho).
transportadas para uma região de plasma com temperatura elevada entre 5500 a 7000k (Figura 18 b e c).
Durante essa passagem, as gotículas são secas e microcristais são formados, dando origem aos átomos dos elementos que compõem a amostra. No plasma é possível excitar átomos e íons gasosos. Como resultado do processo de excitação, são obtidos espectros de emissão das linhas atômicas e iônicas dos elementos de interesse, onde é possível identificar os elementos pelos comprimentos de onda (nm) característico e calcular a concentração a partir das intensidades das linhas de emissão correspondentes.
Uma solução contendo cinco concentracões conhecidas de Ca e P (0,01; 0,1; 1; 2,5 e 5 mg/l) foi utilizada para a calibração do aparelho e definição dos espectros de emissão atômica específico para cada mineral, sendo o cálcio avaliado no comprimento de onda 393.366 e, para o fósforo, 213. 618 (Figura 19 a e b).
Os dados foram obtidos com auxílio do software do próprio equipamento conforme os parâmetros operacionais: Frequência do gerador 40MHz; potência da radiofrequência 1,2 kW; Vazão do gás do plasma 12L min-1; Vazão do gás auxiliar 0,5 L min- 1; Vazão do gás de nebulização 0,6 L min-1; Vazão da amostra mL min-1; Altura de observação 12 mm; Velocidade da bomba 60RPM; tempo de integração 15s.
a) Figura 19. Calibração do equipamento: a) padrões conhecidos de Ca e P; b) determinação dos comprimentos de onda de interesse.
11. Microscopia Eletrônica de Varredura
Com a finalidade de observar qualitativamente o esmalte de superfície das amostras foi utilizado o microscópio eletrônico de varredura MEV (JEOL- JSM 5600 LV- Tókio, Japão). Duas amostras de cada grupo foram selecionadas ao final de todo o experimento. As amostras foram lavadas em cuba ultrassônica e secas em papel absorvente; em seguida, as amostras foram desidratadas por imersão em soluções crescentes de álcool e metalizadas com liga de ouro. Em sequência, foram fixadas em discos metálicos para cobertura com ouro. Foram obtidas fotomicrografias de áreas representativas de cada grupo no estudo com uma ampliação de 1000X. (Figura 20).
Figura 20. Análise microscópica. a) amostras desidratadas e fixadas nos stubs; b) metalizadora; c) amostras finalizadas e metalizadas; d) microscópio eletrônico de varredura.
a)
b)
c)
ANEXOS
Anexo 1 - Verificação de originalidade e prevenção de plágio por meio do software