3. Fundamentos Teóricos
4.3 Metodologia Experimental
4.3.1 Produção dos Biocarvões de B.cereus e C.vulgaris
Neste projeto, foram preparados dois biocarvões, que foram depois usados como resina de adsorção de metais. Os biocarvões, foram preparados a partir de 2 fontes biológicas diferentes: a partir da microalga C. vulgaris e da bactéria B. cereus.
4.3.1.1 Crescimento celular de Bacillus cereus
Enquanto, que para a microalga, não houve a necessidade de fazer crescimento da mesma, pois foi cedida uma amostra na forma liofilizada e pronta a ser imobilizada, no caso da bactéria escolhida, teve de se fazer o seu crescimento, em erlenmeyers de 250 mL recorrendo a 100mL de meio LB (Luria Bertani), por erlenmeyer. Foram produzido cerca de 12 000 mL, de meio de B.cereus. Estes meios foram esterilizados por calor húmido a 121 ºC, durante 15min. A fita de autoclave usada em cada frasco mudou de cor, comprovando que a esterilização foi bem-sucedida. Cada um destes erlenmeyers foi inoculado com 100 µL de suspensão de Bacillus cereus, armazenada a -80ºC na câmara de fluxo laminar, em condições de assepsia. Posteriormente, estes erlenmeyers foram colocados na incubadora orbital a 30ºC (temperatura ótima de crescimento) overnight (cerca de 12h) a 180rpm. Na bibliografia este tempo é o sugerido para se atingir o início da fase estacionária, maximizando o número de células [44].
Depois, as culturas foram centrifugadas, numa centrifuga refrigerada, com tubos de falcon de 50 mL, durante 15 min, a 4 ºC a 4590 rpm. O sobrenadante, foi depois descartados para o erlenmeyer original e guardou-se o pellet de células de Bacillus cereus. Os tubos de falcon com os precipitados celulares, foram depois invertidos, sob papel adsorvente, para escorrer o excesso de sobrenadante ainda existente, no pellet. Os sedimentos celulares recolhidos foram secos a 37 ºC, numa estufa durante 120 h.
4.3.1.2 Imobilização das células em esferas de alginato de sódio
Neste projeto, visa-se trabalhar com biocarvões, logo com células não viáveis. Para a preparação destes carvões, seguiu.se o procedimento descrito por Nakbanpote et al. (2002) [5]. Neste artigo, os investigadores começam por imobilizar as células, em esferas de alginato de sódio.
Quando os sedimentos celulares de B. cereus, já se encontravam totalmente secos, foram moídos, com a ajuda de uma mó e pilão, até obter um pó fino (Figura 13). Considerou-se que após esta secagem e moagem, as células de B. cereus encontravam-se em condições idênticas, às da microalga liofilizadas.
25 Figura 13 – Células de B.cereus, liofilizadas.
Ambos os organizamos, C.vulgaris e o B.cereus, foram imobilizados da mesma forma, em esferas de alginato de sódio. Para ambos as amostras biológicas, foi medida uma massa de 5g de material liofilizado/seco e adicionou-se alginato de sódio (3% m/v), até de obter uma solução viscosa, mas suficientemente líquida para se conseguir pipetar solução com uma seringa de 1mL com agulha de 0,7mm. Uma seringa pipeta 1mL da mistura de alginato de sódio com células, enquanto outra seringa semelhante vazia “corta” as esferas, que saem da seringa em partículas mais pequenas para um tubo de falcon, com cloreto de cálcio (2%
m/v), para se dar a formação das esferas. A necessidade de usar a segunda seringa prende-se com a dificuldade encontrada em preparar esferas pequenas uniformes e com o mínimo de ar no seu interior (tornando-as muitas vezes ocas).
As esferas obtidas, foram filtradas com o auxílio de um passador com filtro, para que não houvesse perda de material e lavadas com água destilada.
4.3.1.3 Produção dos biocarvões
Com o objetivo de obter o biocarvão, as esferas foram posteriormente colocadas em cadinhos e colocadas na mufla a 400ºC, durante 4h. Os biocarvões, obtidos ficaram a arrefecer no exsicador durante 12h, para depois serem tratadas com uma solução de HCL a 2M, seguido de lavagem com água destiladas. Posteriormente, o biocarvão foi a secar numa estufa a 80ºC durante 24h.
4.3.2 Montagem de uma coluna de leito fixo
Adaptaram-se 2 seringas descartáveis de 5 mL, como colunas cromatográficas, com 0,10 g de biocarvão produzido em cada. Estas colunas tinha uma altura de 5,5 cm e 1,5 cm diâmetro de resina, para os dois tipos de amostras biológicas. De referir, que para impedir a perda de carvão, inseriu-se um filtro de 0,2 µm na base, mas com o filtro deslocava-se conduziu à perda completa de resina introduzida. Por este motivo, adaptou-se um filtro (tipo frit) de 20 µm na base, para que não houvesse perdas de resina e outro na parte superior, do carvão, ficando este retido entre os frits. Na Figura 14, pode-se ver o esquema de montagem dos leitos fixos preparados.
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Figura 14 - Esquema da montagem da coluna de adsorção de leito fixo de biocarvão, produzido de B.cereus e C.vulgaris.
4.3.3 Quantificação da prata por Espectrofotometria UV/Visível
Com o objetivo de se determinar a quantidade de prata adsorvida pela resina, foi necessário fazer um espetro da solução de nitrato de prata a 0,01M, para conhecer o seu máximo de absorção, num varrimento entre 200-700nm. Após identificação do máximo de adsorção do nitrato de prata, pode-se construir uma reta de calibração, para concentrações entre os 0 e os 2000 mg/L, com os valores presentes na Tabela 6 e desta forma, se obter uma relação entre a adsorvância e a concentração de prata.
Tabela 6 – Valores de concentração de nitrato de prata (AgNO3) em mg/L e volumes de solução mãe de nitrato de prata (Vsol.mãe) e água (Vágua), em µl, para perfazer o volume final de 1,5mL.
[AgNO3] (ppm) Vsol. mãe (µl) Vágua (µl)
0 0,0 1500
50 4,4 1500
75 6,6 1500
100 8,8 1490
150 13,2 1490
200 17,7 1480
250 22,0 1480
300 26,0 1470
400 35,0 1460
500 44,0 1460
600 53,0 1450
700 62,0 1440
800 71,0 1430
900 80,0 1420
1250 110,0 1390
1500 132,0 1370
1750 154,0 1350
2000 180,0 1320
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4.3.4 Isotérmica de adsorção de prata pelos biocarvões de B. cereus e C.
vulgaris
Obtiveram-se as isotérmicas de adsorção de prata a 30ºC para os dois biocarvões produzidos de células de C. vulgaris e B. cereus imobilizados, procedendo do seguinte modo:
a) Moer os biocarvões, separadamente, com mó e pilão de modo a obter um pó fino.
b) Identificar 2 séries de tubos tipo eppendorf com 7 tubos cada. Uma série para o biocarvão de C.vulgaris (CV) e outra para o biocarvão de B.cereus (BC). O 7.º tubo de cada série corresponde ao branco de cada biocarvão (sem adição posterior de solução de prata).
c) Medir 0.01g de biocarvão para cada tubo identificado em b) (gasto de 0.07 g de cada biocarvão por 14 tubos no total).
d) Adicionar os volumes de solução de nitrato de prata (0.01M ou 0.5M) e água destilada, de acordo com a Tabela 7 aos tubos com os biocarvões, preparados em c). Adicionar o mesmo volume total, mas só com água destilada aos tubos marcados como “brancos”.
Tabela 7 – Concentração (em nitrato de prata, ppm) das amostras a preparar e respetivos volumes de solução mãe de nitrato de prata e água destilada para preparar cerca de 1500 µl (Vtotal (µl)). Este procedimento foi feito
para os dois biocarvões, o de C.vulgaris (CV) e B.cereus (BC).
Tubo (#) [AgNO3] (ppm) [AgNO3] (M) V (AgNO3 mãe) (µl) VÁgua (µl) VTotal (µl)
1 150 0,01 132 1370 1502
2 500 0,01 440 1058 1498
3 1000 0,01 880 620 1500
4 1500 0,01 1320 180 1500
5 1750 0,5 31 1470 1501
6 2000 0,5 35 1460 1495
Branco 0 NA NA 1500 1500
e) Tapar tubos preparados com a respetiva tampa, homogeneizá-los num agitador vórtex e colocá-los numa caixa fechada, ao abrigo da luz, numa incubadora orbital a 250rpm, a 30ºC durante 16h.
f) Após 16h, retirar os tubos da incubadora orbital e centrifugá-los durante 15 min a 1000 rpm, numa microcentrífuga.
g) Pipetar os sobrenadantes para novos tubos tipo eppendorf limpos, perturbando o menos possível o biocarvão no fundo de cada tubo.
h) Preparar a curva de calibração de nitrato de prata em água, como descrito em 4.3.3.
Ler a absorvância dos vários pontos da reta de calibração a 301 nm, bem como das soluções de nitrato de prata a 0,01 e 0,5 M e dos sobrenadantes obtidos em g).
i) Converter com a reta de calibração obtida para concentração de nitrato de prata (e prata) de cada amostra de sobrenadante.
j) Determinar as constantes da equação de isotérmica de Langmuir.
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4.3.5 Testes de precipitação da prata
Com o objetivo de estudar qual o melhor eluente para remover a prata potencialmente adsorvida nos biocarvões, testaram-se 3 soluções diferentes: solução de tiureia 0.5M em água e solução de amónia a pH 10. Para isso, seguiu-se o procedimento abaixo:
a) Ler pH da solução de amónia a pH10, após calibração do equipamento para certificar do valor. Ler o valor do pH para a solução de nitrato de prata a 0.05M.
b) Adicionar 1 ml de solução de amónia (pH 10) a 0.5 ml de nitrato de prata a 0.5 M.
Homogeneizar num agitador vortex. Observar se há turbidez ou formação de precipitado. Aguardar 30 min.
c) Centrifugar 10.000 rpm durante 2 min numa microcentrifuga. Verificar se houve formação de precipitado. Retirar 700 ul do "sobrenadante".
d) Fazer a reta de calibração a 301 nm no espectrofotómetro, de acordo com o descrito em 4.3.3.
e) Ler a absorvância a 301 nm do sobrenadante obtido em c), bem como do branco - 1 ml de Amónia a pH 10. Comparar a absorvância 301 nm de c) com a da amostra composta por 1 ml água + 0,5ml de nitrato de prata 0,5M. Retirar a absorvância do branco à amostra.
f) Ler pH da solução da solução de tiureia a 0,5M, após calibração do equipamento para certificar do valor.
g) Adicionar 1 ml de solução de solução de tiureia 0,5M a 0,5 ml de nitrato de prata a 0,5 M. Homogeneizar num agitador vortex. Observar se há turbidez ou formação de precipitado. Aguardar 30 min.
h) Centrifugar 10.000 rpm durante 2 min numa microcentrífuga. Verificar se houve formação de precipitado. Retirar 700 ul do "sobrenadante".
i) Fazer a reta de calibração a 301 nm no espectrofotómetro, de acordo com o descrito em 4.3.3.
j) Ler a absorvância a 301 nm do sobrenadante obtido em h), bem como do branco- 1 ml de tiureia 0.5M. Comparar a absorvância 301 nm de h) com a da amostra composta por 1 ml água + 0,5ml de nitrato de prata 0,5M. Retirar a absorvância do branco à amostra.
4.3.6 Testes de eluição da prata dos biocarvões em modo batch
Tendo em conta os resultados da precipitação observados obtidos em 4.3.5, procedeu-se à eluição da prata das amostras de biocarvões obtidas em 4.3.4, após remoção dos sobrenadantes com tiureia 0,5 M. O procedimento seguido, encontra-se descrito abaixo:
a) Centrifugar os tubos com as amostras de biocarvão (0.01g em cada tubo - ensaio das isotérmicas) de B. cereus durante 2 min a 12000 rpm.
b) Centrifugar os tubos com as amostras de biocarvão (0.01g em cada tubo - ensaio das isotérmicas) de C. vulgaris durante 2 min a 12000 rpm.
c) Remover o sobrenadante de a) e de b) o mais possível, com menor perda de biocarvão.
d) Adicionar a cada um dos tubos com o biocarvão, 1.5 ml de tiureia 0.5M e homogeneizar no agitador vórtex.
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e) Colocar os tubos numa caixa, protegidos da luz e agitar numa incubadora orbital a 30 ºC, durante 24h.
f) Retirar ao final de 24 h, os tubos correspondentes com biocarvão de BC e CV e centrifugar 2 min a 12000 rpm. Retirar 1 ml de sobrenadante para tubos limpos identificados.
g) Preparar uma reta calibração de AgNO3 a 301 nm segundo o descrito em 4.3.3.
h) Ler a absorvância a 301 nm da tiureia a 0,5M, bem como dos sobrenadantes de BC e CV.
i) Calcular com base nas isotérmicas a massa adsorvida e eluída.
4.3.7 Curvas de breakthrough ou de rutura
Para se caracterizar cada um dos biocarvões produzidos, nomeadamente prever o perfil de concentração-tempo ou curva de breakthrough (curva de rutura) recorreu-se ao seu traçado em modo descontinuo, com as seringas previamente preparadas, com cada um dos biocarvões, descrito em 4.3.2 e à Bomba do HPLC da Perkin Helmer para bombear as soluções, como representado na Figura 15.
Figura 15 – Esquema do sistema montado (a) Solução a adsorver ou a eluir a prata; b) bomba de HPLC; c) coluna que se preparou no ponto 4.3.2; d) frações recolhidas).
Antes de se iniciar os ensaios de breakthrough, as seringas com o respetivo biocarvão (B.
cereus, designado por BC e C. vulgaris, designado por CV) foram extensivamente lavadas com água destilada para eliminar a existência de resíduos ou impurezas antes de iniciar o procedimento propriamente dito e que poderia interferir nos resultados. Esta lavagem foi feita com um caudal de 1 ml/min (verificar se a compactação da coluna sofria alterações) durante 30 min. Posteriormente, parou-se a bomba e quando já não havia líquido por cima do filtro do carvão, alimentou-se a seringa com uma solução de nitrato de prata, a uma concentração de 0,01M e pH de 3, a um caudal de 0,25 ml/min. Foram recolhidas frações do eluído com 0.5 ml de volume, durante 60 min. Para determinar se o sistema já tinha entrado em rutura, leu-se a absorvância a 301 nm das frações recolhidas. Quando a absorvância atingiu o valor da absorvância da solução de nitrato de prata a 0.01M, foi terminada a alimentação de solução.
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De seguida, colocou-se o sistema em água destilada para remover o que não adsorveu ao biocarvão e eventuais complexos, para além de alterar a solução. Novamente, recolheram-se frações de 0.5 ml, durante 40 min a um caudal de 0.5 ml/min. Para determinar recolheram-se o sistema já estava estável em água, leu-se a absorvância a 301 nm das frações recolhidas.
Quando a absorvância atingiu o valor da absorvância da água destilada, foi terminada a alimentação desta.
Por fim, a seringa com o biocarvão (de BC ou CV) foi alimentada com tiossulfato de sódio 0,5 M, a pH 9 com tampão de carbonato, com o intuito de dessorver, a prata adsorvida na coluna. Foram recolhidas frações do eluído com 0.5 ml de volume, durante 60 min. Para determinar se houve algum pico de eluição, leu-se a absorvância a 301 nm das frações recolhidas. Quando a absorvância atingiu o valor da absorvância da solução de tiossulfato, foi terminada a alimentação desta solução. Repetiu-se posteriormente, o passo de lavagem com água destilada durante 15 min, sem recolha de frações. A seringa com biocarvão foi posteriormente armazenada a 4ºC até posterior utilização. Todo o processo de construção de curva de rutura foi igual para os 2 biocarvões.
Este processo de eluição foi repetido com outra solução, desta feita de tiureia a 0,5M, de igual forma, para uma nova porção de 0,01 g de biocarvão tanto de BC como de CV. Para a quantificação da prata, preparou-se sempre uma reta de calibração de nitrato de prata em água, como descrito em 4.3.3.
Figura 16 – Processo utilizado para construção das curvas de breakthrough.ou de rutura com o biocarvão de B.
cereus (BC) ou de C. vulgaris (CV).
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4.3.8 Análise dos biocarvões por microscopia dos eletrões secundários (SEM) Foi realizada por SEM-EDS, no Laboratório de Microscopia Eletrónica do Instituto Superior Técnico, “MicroLab”, num equipamento JEOL JSM-7001F, com analisador elementar EDS (Oxford INCA 250) uma análise da estrutura superficial e morfológica, bem como a análise elementar à superfície das amostras dos biocarvões produzidos. Esta análise não foi realizada pela discente.
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