Metodologia Experimental 1 Material

5.3.1.1 Microrganismo

A levedura Saccharomyces cerevisiae foi utilizada nos ensaios fermentativos. O microrganismo foi doado pela Faculdade de Engenharia de Alimentos–FEA/UNICAMP, que por sua vez é proveniente da Usina Santa Adélia-SP. A levedura foi mantida em ágar inclinado, sob refrigeração, sendo repicada periodicamente.

5.3.1.2 Inóculo

O inóculo utilizado na fermentação foi preparado em três etapas, a saber: etapa de ativação, de crescimento e adaptação. O meio utilizado em cada etapa foi previamente

128 esterilizado em autoclave por 15 minutos a 121 ºC. Os repiques e transferências da levedura Saccharomyces cerevisiae foram realizados em câmara de fluxo laminar. Antes do manuseio, a câmara foi sanitizada com álcool 70 ºGL, com posterior incidência de raios UV (ultra violeta) por 30 minutos.

Inicialmente faz-se a ativação da Saccharomyces cerevisiae proveniente da cultura de estoque transferindo-a para um tubo de ensaio contendo meio com ágar. O processo de ativação é efetuado mantendo-se o microrganismo neste meio por 24 h a 30 ºC. Na Tabela 5.2, seguem as concentrações do meio de ativação, tal como utilizadas no trabalho de ANDRADE (2007).

Tabela 5.2: Composição do meio de ativação para cultivo de S. cerevisiae (FONTE:

ANDRADE, 2007) Composto Concentração (g/L) Extrato de Levedura 3 Extrato de Malte 3 Peptona 5 Glicose 10

Para o preparo do meio semi-sólido para ativação da levedura, foi adicionado ao meio apresentado na Tabela 5.2, 20 g/L de ágar.

Após as 24 h, o microrganismo foi repicado do ágar inclinado para um tubo contendo 10 mL de meio nas mesmas composições do meio de ativação sem, no entanto, utilizar ágar. Após o repique, o tubo foi mantido novamente a 30 ºC por 24 horas. Passadas as últimas 24 horas, fez-se o repique do microrganismo para um meio sintético (cuja composição é apresentada na Tabela 5.3) contido em um Erlenmeyer de 250 mL de meio. O Erlermeyer permaneceu sob agitação de 150 rpm a 30 ºC pelo período de 24 horas em shaker, completando, assim, a etapa de crescimento.

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Tabela 5.3: Composição do meio de crescimento utilizado para inóculo (FONTE:

ANDRADE, 2007) Composto Concentração (g/L) Sacarose 20 Extrato de Levedura 5 K2HPO4 5 NH4CL 1,5 KCL 1,15 MgSO4.7H2O 0,65

Por fim, o conteúdo do Erlermeyer da etapa de crescimento foi vertido em um Erlermeyer de 600 mL (totalizando 400 mL) contendo meio industrial (melaço) a 100 g/L de açúcares (soma de sacarose, glicose e frutose), sendo mantidas as mesmas condições da etapa anterior (150 rpm de agitação e 30 ºC de temperatura). Esta última etapa é denominada etapa de adaptação, pois contém o meio que é utilizado na fermentação. Nesta última etapa, o microrganismo permaneceu em crescimento por mais 24 horas.

5.3.1.3 Meio de Fermentação

O melaço de cana-de-açúcar (Mel tipo "B"), cedido pela Usina São João (Araraquara- SP), contendo 70 % de pureza em açúcar (ART) foi o meio utilizado na fermentação. O melaço tipo "B" é mais rico em açúcares comparativamente ao melaço final, apresenta também uma boa quantidade de minerais fazendo deste uma melhor opção (FERNÁNDEZ- LÓPEZ et al., 2012). O melaço foi diluído com água para as respectivas concentrações dos ensaios (< 300 g/l).

O reator Bioflo 415 (New Brunswick Scientific Co., Inc.), utilizado nos ensaios, é “auto-autoclavável” o que permitiu a esterilização do meio diretamente nele. O tempo de esterilização foi de 30 minutos, e a temperatura de 121ºC.

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5.3.2 Métodos Analíticos

5.3.2.1 Concentração de células totais

A concentração das células em base seca foi determinada por gravimetria (massa seca). Amostras do meio fermentado foram retiradas periodicamente e depois centrifugadas a 3300 rpm em temperatura ambiente por 15 minutos.

O precipitado foi lavado por 2 vezes com água destilada e seco na temperatura de 70 ºC em placas de petri previamente pesadas.

5.3.2.2 Concentração de açúcares, etanol e glicerol por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)

Os sobrenadantes da etapa de centrifugação (para determinação da concentração celular) foram diluídos e filtrados diretamente em vials utilizando filtros de membrana GS em éster de celulose com diâmetro de poro de 0,22 µm (Millipore). Na fase líquida foram realizadas análises de açúcares (sacarose, glicose e frutose), de etanol e glicerol utilizando um cromatógrafo líquido modelo 1260 Infinity HPLC (Agilent Technologies) com detector de índice de refração IR e DAD UV-vis. A coluna utilizada para separação foi a Aminex HPX87H (Bio-Rad Laboratories), com temperatura controlada a 30 ºC. O cromatógrafo foi operado utilizando-se uma fase móvel ácida de pH 2,6. A fase móvel consiste de uma solução preparada com água ultra-pura e ácido sulfúrico. A vazão pela coluna foi de 0,6 mL/min.

Os padrões consistiam em soluções de glicose, frutose, sacarose, etanol e glicerol na faixa de concentração entre 0,01-15 g/L.

5.3.3 Operação do sistema fermentativo extrativo por arraste gasoso

A operação do sistema teve início com a alimentação de meio (melaço diluído) no reator Bioflo 415 (New Brunswick Scientific Co., Inc.). Após a esterilização do meio, por intermédio da auto-autoclavagem interna no reator, foi adicionado o inóculo possuindo em torno de 10 % em relação o volume total de meio reacional.

A fermentação foi conduzida utilizando-se 4 L de melaço diluído em regime descontínuo (batelada). Após um período de 10 h, foi injetado o gás (CO2) continuamente no fermentador, juntamente com o acoplamento das conexões no condensador externo (Figura

131 5.2). Concomitantemente a este procedimento foram retirados instantaneamente cerca de 2 L de meio de fermentação e, por fim, foi obstruída a saída usual de gases do fermentador para que todo o gás de exaustão passasse pelo condensador.

Para evitar contaminação do sistema, as conexões e o procedimento de acoplamento do condensador ao fermentador, efetuada após o início da fermentação, foram realizados na presença de chama, com lavagem das conexões com álcool 70 ºGL, e operação com pressão positiva de gás (inserido de dentro para fora do sistema). A vazão de gás inserida no reator variou de 4 a 10 L/min. O condensador externo foi mantido em temperaturas entre -4 a -5 ºC, sendo que o resfriamento foi realizado por intermédio de um banho ultratermostizado MA 184 (Marconi®), o qual foi alimentado com uma solução de água e etilenoglicol (30 % em massa) cuja finalidade é alcançar temperaturas abaixo de 0 ºC.

O reator utilizado possui controle de temperatura e agitação. Em todos os experimentos, a temperatura do meio reacional foi mantida em 34 ºC, e agitação em 300 rpm. O controle do pH do meio não foi realizado. Foram colhidas amostras do caldo fermentado em intervalos de tempo pré-estabelecidos para a realização das análises de concentração de açúcares (sacarose, glicose e frutose), etanol e células.

5.3.4 Operação do sistema fermentativo em batelada

Para comparação dos resultados obtidos (rendimento, produtividade, concentração de etanol no reator, entre outros) com o processo fermentativo extrativo por arraste gasoso, foram necessários ensaios com o processo fermentativo em batelada. Neste caso, o sistema fermentativo foi composto somente pelo fermentador não sendo alimentado gás no sistema.

Os procedimentos de esterilização, preparo do meio, manutenção de temperatura e agitação foram os mesmos dos adotados nos experimentos com extração (Secção 5.3.3).

5.4 Aplicação do Arraste Gasoso em Solução Sintética de Etanol com Adição de