3.2.1 Processo de compostagem
A metodologia de compostagem em todos os experimentos foi a compostagem longa seguida de pasteurização a vapor.
Para seu preparo foi utilizado como matéria prima, bagaço de cana-de- açúcar e feno de capim coast-cross na proporção de 1:1 em camadas alternadas, acrescentado água em quantidade suficiente para que o composto atinja umidade entre 65 a 75 %. O composto foi revolvido a cada dois dias, adicionando água sempre que necessário. Na quarta reviragem foi suplementado com 10% de farelo de trigo, 2% de calcário, 2% de gesso agrícola e 1,7% de uréia, tendo como base para o cálculo da suplementação o peso total do substrato base desidratado.
As reviragens foram realizadas normalmente nas segundas, quartas e sextas- feiras por um período de quatro semanas. Depois o composto foi acondicionado em túnel de pasteurização a vapor. O processo foi conduzido em duas etapas de 12 horas, contadas a partir do início de emissão de vapor sob o composto. Após
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a primeira etapa, o composto foi retirado e homogeneizado antes de ser submetido à segunda etapa de pasteurização.
3.2.2 Preparo do inóculo de Agaricus brasiliensis.
Simultaneamente ao início do processo de compostagem, preparou-se o inoculante do Agaricus brasiliensis. Este inóculo foi preparado com a linhagem CS1 da coleção do Laboratório de Cogumelos Comestíveis da UFLA. A cultura foi reativada e mantida em meio de cultura BDA (batata dextrose agar), incubado em câmara BOD a 26º C. Essa cultura foi considerada a matriz primária para o preparo do inoculante do A. brasiliensis.
A matriz secundária foi preparada em substrato contendo 90% de arroz em casca e 10% de farelo de trigo, suplementado com 2% de gesso agrícola e 2% de calcário calcítico, tendo como base o peso total da mistura dos ingredientes principais (arroz em casca e farelo de trigo).
Primeiramente o arroz foi pré-cozido em água fervente por 20 minutos, como pré-tratamento de desinfestação e para absorver umidade. Paralelamente o farelo de trigo foi umedecido com mesmo volume em água e autoclavado por 30 minutos. Em seguida, foram misturados e acrescentados os suplementos, sendo então acondicionados em frascos com capacidade de 200 mL, tampados com algodão e autoclavados por 1 hora duas vezes com intervalo de 24 horas. Os frascos, após atingirem temperatura ambiente, foram inoculados em câmara de fluxo laminar com fragmentos do meio BDA colonizados por A. brasiliensis.
3.2.3 Inoculação do composto com A. brasiliensis
Após o término da pasteurização do composto, esperou-se 24 horas para o mesmo atingir a temperatura ambiente, sendo então retirado do túnel, homogeneizado e acondicionado em sacolas plásticas com capacidade para 10 kg de composto e inoculado com aproximadamente 3% do inoculante sobre o
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composto e misturados. As sacolas foram fechadas e incubadas em temperatura ambiente. No momento que ocorreu a completa colonização das sacolas, aproximadamente 30 dias após a inoculação, foram retiradas amostras aleatórias do composto, que foram depois pesadas e levadas para estufa de ventilação forcada a 65ºC para determinar o teor de umidade do substrato colonizado, com objetivo de calcular posteriormente a eficiência biológica de cada tratamento.
3.2.4 Indução da frutificação e colheita dos cogumelos
Para indução da frutificação, 4 kg do composto colonizado foram acomodados em vasos de polietileno de 20L. Após o nivelamento do composto, o mesmo foi coberto com cinco centímetros da camada de cobertura previamente preparada. A terra utilizada para a cobertura do composto foi o Latossolo Vermelho distroférrico de horizonte B adicionado de 20% (v/v) de carvão vegetal moído, com pH ajustado para 7,0. O ajuste do pH foi feito adicionando-se calcário calcitico, com base na análise do solo, no momento do acréscimo do carvão vegetal e incubação por 15 dias.
Os vasos assim preparados foram incubados na sala de cultivo de cogumelos à temperatura ambiente e a camada de cobertura foi mantida úmida durante todo o período de cultivo, com regas periódicas. A partir do momento em que a camada de cobertura tornou-se completamente colonizada, o exaustor da casa de cultivo foi ligado por um período de aproximadamente duas horas pela manhã e ao final da tarde, para garantir maior aeração do ambiente. O piso foi molhado quatro vezes ao dia com objetivo de manter a umidade relativa do ar acima de 70%.
A colheita iniciou-se aproximadamente 25 dias após a indução da frutificação. Os cogumelos foram colhidos sempre que apresentaram tamanho máximo e antes de iniciar a abertura do píleo, quando as paredes laterais do mesmo apresentavam-se paralelas ao estipe. O excesso de terra de cada
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cogumelo foi removido com auxílio de um pincel antes que fosse feita a pesagem.
3.2.5 Cálculo da eficiência biológica e produtividade
Foram retiradas amostras aleatórias do composto colonizado de cada tratamento em três repetições de aproximadamente 200 gramas, acomodadas em sacos de papel, pesadas e levadas à estufa de ventilação forçada à temperatura de 65ºC até a obtenção de peso constante. A eficiência biológica de cada tratamento foi determinada considerando a massa de cogumelos frescos colhidos pelo peso do composto desidratado, em percentagem (EB = [massa de cogumelos frescos/massa de composto desidratado] x 100). A produtividade foi calculada de forma semelhante porém, considerando-se a produção de cogumelos frescos por composto úmido (P = [massa de cogumelos frescos/massa de composto úmido] x 100).
3.2.6 Determinação do crescimento micelial
Para a determinação do crescimento micelial, foram utilizados dois quilos do composto para cada tratamento, acomodados em sacos plásticos transparentes e inoculados com o A. brasiliensis somente na superfície superior do composto. Após 16 dias, foi avaliado o crescimento micelial em cm/dia, tomando-se 6 medidas em pontos eqüidistantes em cada saco, as quais foram convertidas em uma média.