METODOLOGIA 1 Local das análises

a pesquisa foi realizada no laboratório de Quími- ca Sanitária e Ambiental (LAQUISA) da Estação Experimental de Tratamento Biológico de Esgoto Sanitário (EXTRABES), situada na cidade de Cam- pina Grande/PB (07º 14’ 22’’ S e 35º 53’05’’ W),

em área pertencente à Companhia de Água e Es- goto de Campina Grande – CAGEPA, cedida em sistema de comodato à Universidade Estadual da Paraíba (UEPB).

2.2 Escolha dos reagentes e padrões

Os ácidos graxos voláteis escolhidos foram ácido acético, ácido propiônico, ácido isobutírico, áci- do butírico, ácido isovalérico, ácido valérico. Para preparação dos analitos padrões foram escolhi- dos ácidos P.A. da marca Sigma Aldrich que são apresentados na tabela 1.

Tabela 1- Pureza, molaridade e concentração comum dos ácidos graxos voláteis (AGVs).

Ácidos (Sigma Aldrich) Pureza (%) Molaridade (mol/L) Concentração Comum (g/L) Ácido Acético 99,7 17, 43 1046, 85 Ácido Propiônico 99,0 13, 23 980, 10 Ácido Isobutírico 99,5 10, 95 965, 15 Ácido Butírico 99,0 10, 78 950, 40 Ácido Isovalérico 99,0 8, 97 915, 75 Ácido Valérico 99,0 9, 01 920, 70

2.3 Preparação das soluções padrões de ácidos graxos voláteis (AGVs)

No preparo das soluções foram utilizados água Milli Q (para as soluções estoque de 500 mg.L-1_{) e} metanol P.A. (para as diluições). Preparou-se uma solução estoque de 500 mg.L-1 _{para cada ácido} graxo volátil (ácido acético, ácido propiônico, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido isovalérico e ácido valérico) e uma solução estoque de 500 mg.L-1 _da mistura dos seis ácidos; a seguir se realizaram dilui- ções das soluções padrões de cada ácido, até atin- girem as concentrações de 0,5 mg.L-1_{, 1 mg.L}-1_{, 2,5} mg.L-1, 5 mg.L-1_{, as soluções padrões individuais} de cada ácido foram injetadas sequencialmente no cromatógrafo gasoso para obter o cromatograma desses padrões que permitem encontrar as melho-

res condições para a elaboração do método e para a determinação dos tempos de retenção de cada um desses compostos. Em seguida foram prepa- radas diluições a partir da solução estoque de 500 mg.L-1 _{composta pela mistura dos seis ácidos para} montar a faixa de trabalho a ser utilizada. As con- centrações da faixa de trabalho foram: 0,5mg.L-1_, 0,7 mg.L-1_{, 1mg.L}-1_{, 1,5 mg.L}-1_{, 2 mg.L}-1_{, 2,5 mg.L}-1_, 3mg.L-1_{, 4mg.L}-1 _{e 5mg.L}-1_{. Posteriormente cada} concentração que contém a mistura dos seis ácidos foi injetada seis vezes no cromatógrafo para anali- sar a separação dos picos do cromatograma para cada um dos AGVs, os tempos de retenção de cada um, montar a curva de calibração e se analisar as melhores condições do método.

2.4 Cromatografia Gasosa / Espectrometria de Massas

O cromatógrafo gasoso utilizado é da marca Thermo Scientific (TRACE 1300) e o detector é um espectrômetro de massas Thermo Scientific (ISQ QD – Single Quadrupole). As condições cro- matográficas foram estabelecidas com base em dados da literatura e injeções testes para obter as melhores condições cromatográficas, visan- do maior sensibilidade na identificação dos AGVs selecionados. A coluna utilizada no cromatógrafo gasoso é SPB – 624 Capillary GC column, com fase estacionária (6% cianopropilfenil, 94% dimetilpo- lisiloxano) que possui polaridade intermediária. Foram estabelecidas as seguintes variáveis: tama- nho da coluna cromatográfica (30 m x 0,25 mm), espessura do filme (1,4 µm), volume de injeção de 1µl, temperatura do injetor (170°C), modo de inje- ção (splitless), velocidade linear do gás de arraste (gás Hélio – 1mL.min-1_{), temperatura da interface} (250°C), temperatura da fonte de ionização (im- pacto de elétrons) do espectrômetro de massa (230°C), tempo de corte do solvente (4 minutos). Foram testadas algumas rampas de temperatura do forno, e as melhores condições encontradas foram de 35°C, com tempo de espera de 1 minuto,

seguido de aumentos de temperatura na taxa de 20°C.min-1 _{até 100°C com tempo de espera tam-} bém de 1 minuto e continuando com taxa de 50°C. min-1 _{até atingir 200°C com tempo de espera de 3} minutos. Após escolhida a melhor condição cro- matográfica para realização das injeções, proce- deu-se à validação do método.

2.5 Validação de método

A validação da metodologia de análise de AGVs foi realizada utilizando critérios conforme Resolução ANVISA RE nº 899, de 29 de maio de 2003 e docu- mento INMETRO DOQCGCRE-008, de 2016. Para a validação de um método analítico é funda- mental o perfeito controle da qualidade dos reagen- tes a serem usados: fornecedor, marca, qualidade (grau de pureza) da água ou do diluente a ser usado, entre outros. Destaca-se que os reagentes devem ser grau P.A. (Para Análises) e as soluções preparadas com água deionizada ultrapura. A seguir, deve haver controle acurado da exatidão das concentrações dos reagentes, devem-se conhecer os equipamentos a serem utilizados e seu funcionamento, os pontos críticos do aparato e da técnica, e as temperaturas envolvidas no processo que devem ser controladas ao longo de toda a operação. Ainda, para a avalia- ção correta e segura dos critérios estabelecidos pela ANVISA e INMETRO, foram empregadas soluções com diferentes concentrações, em ordem crescente, e as análises para cada uma dessas concentrações foram feitas no mínimo com cinco repetições. Sem esses cuidados cada um dos critérios de validação (linearidade, precisão, sensibilidade, limite de de- tecção, limite de quantificação e exatidão) não seria corretamente estabelecido.

Linearidade: Foram utilizadas soluções padrões

nas concentrações escolhidas para a faixa de tra- balho, foi feita a análise de regressão por mínimos quadrados e a correlação linear foi obtida por meio do R². Foram elaborados os gráficos de resíduos

para cada ácido e realizado o test F (F-Snedecor) na análise da variância (ANOVA) da regressão.

Precisão: Foi obtida com base na repetitividade.

Foram feitas cinco repetições de cada concen- tração de cada ácido, pelo mesmo analista e nas mesmas condições operacionais, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, concentrações baixa, média e alta. Após as repetições foram cal- culados os coeficientes de variação de cada ácido para as três concentrações utilizadas.

Sensibilidade: Foi determinada por intermédio da

inclinação da curva analítica, uma vez que quanto maior a absortividade da substância, maior o coe- ficiente angular e mais sensível é o método.

Limite de detecção e quantificação: Foi prepa-

rada uma solução estoque a partir dos seis ácidos puros e a seguir se procedeu a diluir essa solução até se aproximar do suposto limite de quantifica- ção. Após leitura de cada uma dessas diluições no cromatógrafo sob as condições previamente defi- nidas, foram preparadas três curvas de calibração de cada ácido para obter seus coeficientes linea- res e calcular o desvio padrão desses coeficientes, os valores dos desvios padrões obtidos divididos pelos coeficientes angulares das curvas de ca- libração de cada ácido, multiplicado por três é o limite de detecção e o mesmo valor multiplicado por dez é o limite de quantificação. O limite de detecção também foi calculado multiplicando por três o ruído da linha de base; nesse caso, o limite de quantificação foi aproximadamente 10 vezes maior que esse ruído.

Exatidão: A exatidão foi calculada como a diferen-

ça porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança. A exatidão do método foi determinada após o es- tabelecimento da linearidade, do intervalo linear, sendo verificada a partir de no mínimo nove de- terminações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, três concentrações (baixa, média e alta), com seis réplicas cada uma.

2.6 Amostras para aplicação do método CG/EM para detecção e quantificação de AGVs em matrizes reais

Para avaliar a eficácia do método de recupera- ção dos AGVs em matrizes reais foram utilizadas amostras de lodos e permeado obtidos de reato- res anaeróbios em funcionamento na EXTRABES (um biorreator anaeróbio de membrana dinâmi- ca - BRAnMD, e dois digestores anaeróbios con- vencionais - DAC1 e DAC2) e amostras de lodo originado de resíduos sólidos de um reator em batelada. Os sistemas experimentais BRAnMD e DAC1 e DAC2 foram alimentados com lodo aeró- bio de excesso de um sistema de lodo ativado que por sua vez recebia esgoto doméstico. Este era aduzido do interceptor leste do sistema de esgo- tamento sanitário da Companhia de Águas e Es- gotos da Paraíba (CAGEPA) da cidade de Campina Grande, que passa pelas dependências da Estação Experimental de Tratamento Biológico de Esgoto Sanitário (EXTRABES) e efluente (resíduos sóli- dos) obtidos de um reator em batelada, alimenta- do em batelada, de resíduos obtidos na Empresa Paraibana de Abastecimento e Serviços Agríco- las (EMPASA). Volumes de 100 mL das amostras das matrizes reais foram coletados em béqueres e transferidos para garrafas de polietileno que foram preservadas na geladeira a 4 °C até o mo- mento de uso. Para realizar as análises, 2 g das amostras eram pesadas em um tubo eppendorf, em seguida foram centrifugadas (centrífuga refri- gerada Excelsa 4, mod. 280R-Fanem) durante 15 min, 12.000 rpm. Após centrifugação, o sobrena- dante das amostras foi filtrado em microfiltro de fibra de vidro (GF-2, diâmetro 47 mm), tamanho de poro 0,45 µm (GF-2) e a seguir 5 µL do filtra- do das amostras provenientes de lodo de esgoto foram diluídos quarenta vezes em metanol P.A. e 5 µL do filtrado das amostras provenientes de efluentes de resíduos sólidos foram diluídos cin- quenta vezes em metanol P.A.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO