4.5.1 Metodologia de análise de teor de umidade
As análises de umidade (perda por dessecação) das amostras (Bd in natura, A1, A2, A3, PL-Bd e filmes ativos – PL-Bd 0%, PL-Bd 1,0% e PL-Bd 1,5%), foram realizadas conforme o método número 012/IV, descrito nos métodos físico-químicos para análise de alimentos. Aproximadamente 2,0 g (Pa – Peso da amostra) de amostra foram pesadas em cadinhos previamente secos em estufa, resfriados e medida a sua massa (Pc – Peso do cadinho seco sem amostra), sendo submetidos novamente à estufa a 105 ºC até peso constante (Pd – Peso do cadinho após secagem em estufa com a amostra). O percentual de umidade (%U) foi obtido pela equação 3 (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 2008).
Equação 3
%U = (Pc + Pa) − PdPa . 100
4.5.2 Metodologias de análises de atividades antioxidantes (DPPH, ABTS e FRAP) e compostos fenólicos totais (CFT)
Seguem abaixo as descrições das metodologias utilizadas para a realização das análises das 4 variáveis dependentes (DPPH, ABTS, FRAP e CFT) avaliadas, dos extratos produzidos a partir de A1, A2 e A3, oriundos dos PFC’s (22 e 23), e dos extratos do PSL
produzidos a partir de A2. Para análise de otimização dos extratos para produção do PL-Bd, bem como, do PL-Bd, utilizaram-se as metodologias de DPPH, ABTS, FRAP e CFT.
4.5.2.1 Determinação de compostos fenólicos totais (CFT) in vitro
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, descrito por Singleton; Orthofer e Lamuela (1999), utilizando-se ácido gálico como padrão de referência. Para a realização da análise foi transferida uma alíquota de 500 µL (microlitros) de cada amostra avaliada, nas diluições cabíveis, 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteau diluído em água destilada 1:10 (v/v) para um tubo de ensaio. Após 5 minutos foram adicionados 2 mL de carbonato de sódio (Na2CO3)
4% (m/v), seguido por homogeneização dos tubos de ensaio contendo as amostras. As soluções foram encubadas ao abrigo da luz à temperatura ambiente. Realizaram-se as leituras
das absorbâncias após 2 h de reação, em espectrofotômetro a 740 nanômetros (nm) (Espectrofotômetro marca Spectrum, modelo SP 2000 UV). Foram conduzidas amostras em branco nas mesmas condições de análise, contendo água destilada ao invés de amostra. A curva analítica foi construída no intervalo das concentrações de 0,24 a 6,3 µg mL-1de ácido
gálico, com os resultados expressos em miligramas de EAG (equivalente ao ácido gálico) por grama de amostra (mg EAG g-1) (b.s). Os resultados foram expressos através da equação
da reta da curva analítica de ácido gálico (y = 0,024x-0,002/R² = 99,99%). Uma amostra em branco foi utilizada para zerar o espectrofotômetro.
4.5.2.2 Análise da atividade antioxidante in vitro pelo método da captura do radical DPPH A atividade antioxidante sobre o radical DPPH foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Brand-Williams, Cuvelier e Berset (1995), com modificações por Mensor et al. (2001). A solução de DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) foi preparada a 0,6 mM (milimolar) em solvente etanol. Para a realização da análise foram transferidas alíquotas de 500 µL de cada amostra avaliada, nas diluições cabíveis, seguido da adição de 3 mL de etanol P.A., e 300 µL da solução do radical DPPH. Uma amostra controle também foi conduzida, sendo composta por 300 µL da solução de radical DPPH, adicionados de 3,5 mL de etanol P.A. As leituras das absorbâncias foram realizadas após 30 minutos de reação, em espectrofotômetro a 517 nm. O espectrofotômetro foi zerado com etanol P.A. Foram realizadas análises de DPPH expressas em micro mol de trolox por grama de amostra (µMol Trolox g-1) (b.s), através da construção da curva de trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-
tetrametilcromano-2-carboxílico), no intervalo das concentrações de 10 a 100 µM de trolox (y = -6,184x+0,535/R² = 99,99%).
4.5.2.3 Análise de atividade antioxidante total in vitro pelo método de redução do ferro (FRAP)
Para a determinação da atividade antioxidante, por meio da redução do ferro (FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power), foram utilizadas as metodologias descritas por Rufino et al. (2006) e Kukic et al. (2008). O reagente FRAP foi preparado no momento da análise, através da mistura de 25 mL de tampão acetato (300 mM, pH 3,6), 2,5mL de solução TPTZ (10 mM TPTZ em 40 mM HCl) e 2,5 mL de FeCl3 (Cloreto férrico, 20 mM) em
solução aquosa. Para a realização da análise, uma alíquota de 90 µL de cada amostra avaliada, nas diluições cabíveis, foi adicionada a tubos de ensaio. Em seguida acrescentaram-
se 270 µL de água destilada e 3 mL do reagente FRAP. Os tubos de ensaio foram incubados a 37 ºC em banho-maria por 30 minutos. O espectrofotômetro foi zerado com a solução FRAP. As leituras foram realizadas em absorbância a 593 nm de comprimento de onda. A curva de calibração foi construída através da utilização da solução de sulfato ferroso (FeSO4), no intervalo das concentrações de 100 a 2000 µM. Os resultados foram expressos
em micro mols de ferro (II) por grama de amostra (µMol Fe2+g-1) (b.s), através da equação
de reta da curva padrão (y = 7,220x-0,002/R² = 99,99%).
4.5.2.4 Análise de atividade antioxidante in vitro pelo método da captura do radical ABTS A atividade antioxidante pelo método da captura do ABTS•+foi realizada conforme
metodologias descritas por Re et al. (1999) e Rufino et al. (2007a). O cátion radical ABTS foi formado pela reação da solução ABTS (2,2-azino-bis-(3-etil-benzotiazolina-6-ácido sulfônico)) a 7 mM, com persulfato de potássio (K2SO4) 140 mM, incubados à temperatura
de 25 ºC ao abrigo da luz, durante 16 h. Posteriormente, fez-se a diluição em etanol absoluto até obtenção do valor de absorbância de 0,700 a 734 nm. Para a realização da análise, uma alíquota de 30 µL de cada amostra avaliada, nas diluições cabíveis, foi transferida para tubos de ensaios. Em todos os tubos foram adicionados 3 mL de solução de ABTS•+. As leituras
das absorbâncias foram realizadas após 6 minutos de reação em espectrofotômetro a 734 nm. O espectrofotômetro foi zerado com etanol P.A. A curva analítica foi construída no intervalo das concentrações de 50 a 1500 µM de trolox, com resultados expressos em µM de trolox por grama de amostra (µMol TEAC g-1) (b.s), calculados a partir da equação da reta da curva
analítica de trolox (y = -9,940+0,679/R² = 99,99%).
4.6 MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS NAS AVALIAÇÕES DOS EXTRATOS