Os métodos convencionais de identificação e caracterização de leveduras, baseados em características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, continuam a ser utilizados taxonomicamente. As características morfológicas relacionam-se com a reprodução sexuada e vegetativa, o crescimento microscópico e macroscópico. Quanto às fisiológicas incluem a fermentação de açúcares, a assimilação de compostos de carbono e azoto, necessidades vitamínicas, temperatura máxima de crescimento, resistência à ciclohexamida, entre outras (Duarte, 2000). Porém os métodos convencionais para a identificação das leveduras requerem uma avaliação de aproximadamente 80-100 testes, resultando num processo complexo, muito laborioso e um excessivo consumo de tempo. Para além disso a fragilidade da classificação de leveduras baseada exclusivamente nestes testes tem sido posta em evidência desde há algum tempo (Barnett el at., 1990; Kurtzman e Fell, 1998; Duarte, 2000; Manzanares et al., 2011). Estudos baseados em análises proteicas são desde há muito utilizados no estabelecimento de relações entre os organismos, especialmente em termos evolutivos. A utilização das proteínas para a identificação de leveduras deve-se ao facto da sua função e estrutura serem determinadas pela sequência primária de aminoácidos, a qual se encontra codificada no DNA e assim, se a informação genética estiver conservada, então a estrutura do produto desse gene também se encontra conservada (Duarte, 2000). De entre as análises proteicas destaca-se a análise de perfis isoenzimáticos. As diferenças encontradas em sequências de aminoácidos entre enzimas de diferentes organismos é um reflexo de divergência genética dos organismos. As substituições de aminoácidos podem ser detectadas a partir da distância e migração exibida por enzimas em géis de electroforese, visualizando padrões designados por zimogramas. Comparações de perfis de enzimas têm sido utilizados para estudar relações taxonómicas entre leveduras e na descrição de algumas espécies. (Yamazaki, et al., 1998; Duarte et al., 1999; Duarte, 2000; Sampaio, et al., 2001; Manzanares et al., 2011).
Ao longo das últimas décadas, foram sendo desenvolvidos diferentes métodos moleculares baseados em estudos comparativos de DNA com objectivo de obter uma caracterização e identificação das leveduras mais fiável e sensível.
A comparação do genoma entre organismos diferentes por técnicas de reassociação DNA-DNA tem permitido a determinação da homologia genética existente entre esses mesmos organismos. A utilização desta metodologia permite uma reafirmação ao nível molecular do princípio evolutivo da descendência comum. Se dois organismos estão relacionados, contém nos genomas, sequências de bases que descendem das sequências de um ancestral comum e os organismos mais relacionados conservarão maior proporção dessas sequências de bases, do que organismos com maior divergência (Duarte, 2000). As experiências de reassociação DNA-DNA
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permitem assim avaliar a complementaridade global das sequências de DNA genómico de duas estirpes diferentes. A determinação do grau de complementaridade pode ser efectuada por desnaturação térmica do DNA das amostras e a comparação da cinética de renaturação do DNA de cada uma das estirpes e da sua mistura em partes iguais (Rose e Harrison, 1987).
Kurtzman (1998) refere que a informação dada por estas reassociações teve um impacto considerável na sistemática das leveduras. Esta metodologia permitiu demonstrar que as características morfológicas e fisiológicas utilizadas para a definição de determinadas espécies e géneros são características de taxon, mas sem significado filogenético (Kurtzman, 1994). No entanto, uma das limitações desta metodologia deve-se ao facto do estabelecimento destas relações taxonómicas ser ao nível da espécie, não fornecendo informações sobre relações mais distantes. Além disso para a identificação é necessário fazer comparações caso a caso (Duarte, 2000).
Outros métodos foram desenvolvidos para a identificação de espécies de leveduras usando a informação contida nas moléculas de DNA e RNA. A determinação precisa da sequência de nucleótidos de determinadas regiões do genoma é o método mais directo de análise do DNA, a partir da qual se poderá identificar e caracterizar os organismos. Uma dessas regiões é o RNA ribossómico (rRNA) / DNA ribossómico (rDNA) e a importância desta região deve-se ao facto dos ribossomas estarem presentes em todas as células, e terem uma origem evolutiva comum. O facto de algumas sequências do rRNA/rDNA estarem conservadas e serem homológas para todos os organismos permitem a comparação entre áreas menos conservadas e ainda o estabelecimento de relações evolutivas (Kurtzman, 1994; Kurtzman e Blanz, 1998). A unidade de repetição do rDNA é composta por regiões conservadas e variáveis, repetindo-se em várias cópias pelo genoma. As sequências estão localizadas no gene nas regiões que codificam para as subunidades pequenas, 18S, 5.8S, 5S e grandes 25-28S do rRNA (Figura 1.1). Entre cada subunidade existem as denominadas regiões espaçadoras como a ITS (Internal Transcribed
Spacer) e a ETS (External Transcribeb Spacer), regiões que são transcritas mas não
processadas. Por sua vez, as unidades de codificação são separados pelos espaçadores intergénicos (IGS), também designados por NTS (Non-Transcribed Spacer) que são regiões mais variáveis (Beh et al., 2006; Fernández-Espinar et al., 2006).
|13| A sequência do gene da subunidade 26S do rRNA, em particular os domínios D1 e D2 tem sido igualmente aplicada para o estudo da filogenia dos diferentes taxa de leveduras e revela-se uma poderosa ferramenta na identificação das mesmas. A investigação exaustiva que foi realizada nas últimas décadas evidenciou que estas regiões exibem diferenças suficientes nas leveduras para que se possa avaliar relações intra e inter-específicas (Kurtzman, 1998; Fell et al., 2000; Fernández-Espinar et al., 2006). A disponibilidade destas sequências em bases de dados, especialmente no caso da região D1/D2 do gene do rRNA 26S, torna esta técnica muito útil para classificar uma levedura desconhecida numa determinada espécie quando a percentagem de homologia é superior ou semelhante a 99% embora haja excepções (Kurtzman e Robnett, 1998). Uma das metodologias nomeadamente o método de Sanger baseia-se na cópia de DNA in vitro pela DNA polimerase e a inserção de quatro bases (dNTPs – A, G, T, C). Juntamente com estas bases são adicionadas bases homólogas didesoxirribonucleotidos trifosfato (ddNTP), as quais se ligam ao local da base correspondente, mas que actuam como terminais de transcrição, dado que não possuem o local de ligação da base seguinte originando-se desta forma segmentos de oligonucleótidos com tamanhos diversos. A base terminal é a ddNTP a qual pode estar marcada com um fluoróforo específico e assim ser detectada e identificada por um sequenciador automático de DNA (Towner e Cockayne, 1993).
Mais recentemente outras metodologias de sequenciação de DNA têm sido estudadas as quais são designadas por segunda geração de sequenciação de DNA, como por exemplo a sequenciação electroforética realizada em microchips, a sequenciação por hibridação e a sequenciação em tempo real. Nos últimos anos têm sido estudadas várias aplicações para esta geração de sequenciação e a sua aplicação passa por ressequenciação do genoma completo para a descoberta de mutações ou polimorfismos, mapeamento de rearranjos estruturais, análise de metilações no DNA em larga escala, entre outras. Estas metodologias continuam a ser estudadas e testadas e futuramente espera-se que sejam generalizadas e utilizadas em rotina (Shendure e Ji, 2008).
Os métodos mais rápidos, entre as técnicas moleculares que têm sido utilizados para diferenciar e identificar leveduras ao nível da espécie são baseados em PCR ou reacção em cadeia da polimerase. As técnicas baseadas em PCR consistem na amplificação de determinados segmentos de DNA, sendo esta uma ferramenta base para inúmeras metodologias de análise do DNA. O processo inicia-se com a desnaturação da molécula de DNA por aplicação de temperatura elevada. Após a diminuição da temperatura, dois oligonucleótidos de cadeia simples, complementares às regiões flanqueadoras desse segmento, funcionando como iniciadores ou
primers, ligam-se a essas regiões iniciando-se a síntese de DNA por acção de uma DNA
polimerase termoestável. Seguem-se ciclos de desnaturação, ligação dos primers e elongamento dos mesmo pela acção da DNA polimerase. Os ciclos repetem-se várias vezes, resultando assim na amplificação do segmento alvo (Towner e Cockayne, 1993). Os métodos baseados em PCR tornam-se vantajosos devido à facilidade de execução e para além disso é necessário uma pequena quantidade de DNA, o qual não necessita de ser purificado (van der Vossen e Hofstra, 1996).
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Uma das ferramentas de identificação de microrganismos passa pela análise de restrição de fragmentos do rDNA amplificados por PCR, designada por ARDRA (Análise de Restrição de DNA Ribossómico Amplificado). Esta análise baseia-se na diferença de comprimento dos fragmentos resultantes do corte por endonucleases de um fragmento de rDNA amplificado. Para realizar a análise são escolhidos determinados locais do rDNA, amplificados por PCR, originando elevadas quantidades da região de rDNA a qual se pretende fazer reagir com as enzimas de restrição. Esta metodologia tem permitido a diferenciação de leveduras ao nível da espécie. (Baleiras- Couto et al., 1995, Esteve-Zarzoso et al., 1999; Baleiras-Couto et al., 2005; Fernández-Espinar et
al., 2006).
A análise de restrição pode incidir sobre as diferentes regiões da molécula de rDNA. Guillamón et
al. (1998) utilizaram esta técnica para a diferenciação de 33 espécies de leveduras durante a
fermentação espontânea do vinho, a partir da região que abrange o ITS1, o ITS2 e o gene do rRNA 5,8S. Esteve-Zarzoso et al. (1999) também identificaram um total de 132 espécies de leveduras pertencentes a 25 géneros diferentes, utilizando as mesmas regiões do estudo anterior. Neste trabalho, utilizaram as enzimas de restrição CfoI, HaeIII e HinfI, verificando que cada padrão de restrição obtido com estas enzimas era exclusivo para cada espécie. Em 2003, Capece et al. (2003) identificaram um total de 32 estirpes de leveduras pertencentes a espécies de leveduras não-Saccharomyces associadas ao processo de vinificação. Esta identificação teve como base a análise da região 18S e o espaçador não transcrito (NTS) do rRNA, seguido por restrição das endonucleases HaeIII e MspI.
Num estudo mais recente realizado por Baleiras-Couto et al. (2005) analisaram a diversidade de espécies de leveduras durante a fermentação de vinho tinto. A análise incidiu sobre os padrões de restrição obtidos, pelas enzimas MseI, HinfII e ApaI, de regiões amplificadas do gene do rRNA. Foram diferenciados 19 perfis de um total de 121 estirpes isolados de leveduras não-
Saccharomyces. A identificação das espécies foi confirmada por sequenciação do domínio D1/D2
da região 26S do rDNA, verificando uma elevada correlação dos resultados obtidos.