Animais foram tratados com 5 aplicações intratumorais dos vetores adenovirais (rAdRGD PG-GFP, rAdRGD PG-P19, rAdRGD PG-IFN ou ambos rAdRGD PG-P19+rAdRGD PG- IFN ), com intervalos de δκh. Os tumores foram recuperados 48h após a última vacina e congelados. Em seguida foram submetidos à homogeneização mecânica e extração de RNA.
Extração dos RNAs:
O RNA total dos tumores tratados foi extraído pelo método de TRIzol (Invitrogen, US), segundo instruções do fabricante. Todas as amostras de RNAs foram submetidas a purificação e tratamento com DNase através do RNeasy Mini kit (Quiagen, US), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração dos RNAs foi estimada através de leitura em NanoDrop® (ND-1000 Spectrophotometer, US) e a integridade foi verificada utilizando o 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, US).
GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array
O GeneChip Mouse Gene 1.0 ST (Affymetrics Inc., EUA) foi utilizado na preparação de amostras de RNA para análise de expressão gênica por microarray. O kit realiza a
amplificação linear do RNA e emprega a tecnologia de transcrição in vitro T7oligo dT (IVT). Também conhecida como Eberwine ou método de transcrição reversa IVT (RT- IVT), o processo é considerado padrão ouro para preparação de amostras para análise de expressão gênica.
Transcrição reversa para sintetizar a primeira fita de cDNA
Inicialmente foi feito o Master Mix para a síntese da primeira fita misturando δ l de First- Strand Buffer Mix e 1 l de First-Strand Enzyme Mix, totalizando um volume de 5 l, para uma reação. Foram então adicionados 5 l de RNA total misturado com o RNA Controle poli-A, nas proporções recomendadas pelo fabricante. A reação foi realizada em termociclador por 2 horas a 42°C. Após a incubação, as amostras foram homogeneizadas, centrifugadas rapidamente, colocadas no gelo e imediatamente seguiram para síntese de cDNA dupla-fita.
Síntese de cDNA dupla fita
Foram misturados, para a síntese da segunda fitaμ 1γ l de Nuclease-free Water; 5 l de Second-Strand Buffer Mix e β l de Second-Strand Enzyme Mix, totalizando um volume de β0 l, para uma reação. Sendo então transferidos β0 l da mistura para síntese da segunda fita, para cada amostra de cDNA (10 l). A reação foi incubada em um termociclador a 16°C por 1 hora, seguidos por 65°C por 10 minutos.
Transcrição In Vitro
Em temperatura ambiente, foram misturados δ L de IVT Biotin Label; β0 L de IVT Labeling Buffer; 6 L IVT Enzyme Mix, perfazendo um total de γ0 L, volume necessário para uma reação. Foram transferidos os γ0 L do IVT Master Mix para cada γ0 L de amostra de cDNA dupla fita da reação anterior. A reação foi incubada em termociclador programado para 40°C por 16 horas.
Purificação do cRNA
Antes de iniciar a purificação, a Elution Solution foi pré aquecida a 50-60°C por 10 minutos, e o cRNA Binding Mix foi preparado misturando 10 L de Nucleic acid Binding Beads (previamente agitados e homogenizados) e 50 L de Nucleic acid Binding Buffer Concentrate (quantidade para uma reação). Foram adicionados 60 L de Nucleic acid Binding Mix para o cRNA, em placa com fundo em U. Em seguida foram adicionado 120 L de etanol 100% em cada amostra. Foi utilizado um agitador de placa para homogeneizar
gentilmente as amostras por 2 minutos ou mais. O cRNA liga-se ao Nucleic acid Binging Beads durante esta incubação.
A placa foi transferida para um suporte magnético para capturar as partículas por aproximadamente 5 minutos, ou até a mistura ficará transparente e o Nucleic acid Binbing Beads formar precipitados. Cuidadosamente o sobrenadante foi aspirado sem perturbar o precipitado das partículas magnéticas, ainda no suporte magnético. A placa foi removida do suporte magnético e então adicionado 100 L de Nucleic acid Wash Solution, por amostra, e então agitado em velocidade moderada por 1 minuto. A placa foi levada novamente ao suporte magnético para captura das partículas, e o sobrenadante dispensado sem perturbar o precipitado. Esse procedimento foi repetido pela segunda vez, e então a placa seca foi levada para o agitador por 1 minuto para evaporar o etanol residual.
Para eluir o cRNA purificado contido no Nucleic acid Binding Beads foram adicionados 30 L do Elution Solution pré aquecido (50-60°C) para cada amostra. A seguir, a placa foi vigorosamente agitada por 3 minutos, até as partículas estarem totalmente dispersas. A placa foi transferida para o suporte magnético, para precipitar as partículas, e o sobrenadante, contendo o cRNA, transferido para um novo tubo livre de nucleases. Sua qualidade foi verificada pelo Agilent 2100 Bioanalyzer.
Segundo ciclo de síntese de cDNA
cDNA foi sintetizado por transcrição reversa utilando iniciadores randômicos. 10 g do cDNA foi preparado em ββ L totais. A este foram adicionados β L de inicadores randômicos, incubados 5 min a 25oC e 2 min a 4oC. Então foi adicionado 16 L do máster mix, contendo 8 L de tampão (βnd-Cycle buffer Mix) e κ L de enzimas (βnd-Cycle Master Mix). A reação foi incubada por 10 min a 25°C, 90 min a 42°C, 10 min a 70°C e então 2 min a 4°C.
Hidrólise do cRNA
Nesse procedimento o cRNA é degradado, deixando apenas cDNA de simples fita. Para isso 2ul de RNase H foi adicionada ao produto da síntese de cDNA, incubado por 45 min a 37°C e 2 min a 4°C.
O cDNA foi purifiado segundo o mesmo protocolo descrito previamente para purificação de cRNA.
Fragmentação dos cDNAs
Foram utilizados 5,5 g de cDNA, ajustado para um volume de 31,2 L pela adição de κ l de água livre de RNAses. Foram então adicionados 16,8 L de mix de fragmentação (10 L de água livre de RNase, 4,8 L de 10X cDNA fragmentation Buffer, 1 L de UDG 10 U/ L, 1 L de APE1 1000 U/ L). A reação foi submetida à incubação a 37 °C por 60 minutos, 93 °C por 2 minutos e 4 °C por 2 minutos . O cDNA fragmentado foi avaliado por gel de agarose.
Marcação do cDNA fragmentado
Aos 45 L do cDNA fragmentado foram adicionados 15 ul do mix de marcação (12 L 5X TdT Buffer, 2 L TdT, 1 ul DNA Labeling Reagent). A reação foi incubada a 37 °C por 60 minutos, 70 °C por 10 minutos e 4 °C por 2 minutos.
Hibridização
Foram misturados, para cada amostra, 27 L de cRNA fragmentado; 1,7 L de oligonucleotídeo controle Bβ (γ nM); 5 L de β0X Hybridization controls (bioB,bioC, bioD, cre); 50 L de βX hybridization Mix; 7 L de DMSO; λ,γ L de água livre de nucleases; perfazendo um volume final de β50 L. Este cocktail de hibridização foi aquecido a 99°C por 5 minutos, e a seguir, 45°C por 5 minutos, e então centrifugado à velocidade máxima por 5 minutos para coletar qualquer material insolúvel. Antes de colocar o cocktail de hibridização no GeneChip Mouse 1.0 ST Array (Affymetrics Inc., EUA), este foi preenchido com 80 L de solução de pré-hibridização, e mantido a 45°C por 10 minutos em rotação. Concluída incubação, a solução de pré-hibridização foi removida com uma micropipeta, e o chip carregado com o cocktail de hibridização, num volume de 80 L. O GeneChip foi recolocado no Hybridization Oven 640, (Affymetrix, P/N 800138 110V ou 800139 220V), e mantido a 45°C por 16 horas. Seguindo o protocolo as lâminas foram lavadas, digitalizadas e analisadas conforme Affymetrix GeneChip Scanner 3000 e o software Affymetrics GeneChip Operating (GCOS).
Os dados foram processados e analisados usando TM4. Numa primeira abordagem selecionamos os 50 % dos genes com maior variação, e utilizando o método de analise estatística de microarranjos (Statistical Analysis of Microarrays – SAM) com um FDR menor do que 5. Os genes diferencialmente expressos foram sumetidos a uma nova rodada de analises agora comparados 2 a 2, pelo método de SAM com um FDR menor do que 1.