Microarrays de cDNA

O processo de produ¸c˜ao de um microarray de cDNA (Schena et al., 1995) tem in-

´ıcio com a sele¸c˜ao dos genes que estar˜ao representados no microarray (Duggan et al.,

1999). A partir desta sele¸c˜ao, as sequˆencias dos genes de interesse, que possuem centenas

ou at´e mesmo milhares de bases de comprimento (Tarca et al., 2006), podem ser obti-

das e submetidas a um processo de amplifica¸c˜ao por PCR (Polymerase Chain Reaction). Pelo processo de PCR, milhares de c´opias idˆenticas de cada uma das sequˆencias de inter- esse s˜ao obtidas para posterior fixa¸c˜ao no array. Tais sequˆencias s˜ao ent˜ao purificadas, a fim de eliminar res´ıduos do processo de PCR que possam vir a contaminar o experimento de microarray.

Uma vez obtidas milhares de sequˆencias idˆenticas para cada um dos genes de interesse,

inicia-se sua deposi¸c˜ao. Em uma pastilha, geralmente feita de vidro ou nylon (Duggan

et al., 1999), o processo consiste basicamente da fixa¸c˜ao rob´otica das sequˆencias obtidas

em pontos pr´e-determinados do microarray chamados probes (Duggan et al.,1999). Cada

probe cont´em milhares de sequˆencias idˆenticas, geradas anteriormente por PCR e corre-

sponde a um ´unico gene. Ap´os o processo de fixa¸c˜ao para cada um dos probes, a pastilha

ainda passa por um tratamento qu´ımico e t´ermico a fim de evitar o desprendimento das sequˆencias depositadas. O processo descrito ´e ilustrado pela Figura 3.1(a).

(a) (b)

Figura 3.1: Microarray de cDNA (Adaptado de Harrington et al. (2000)).

utiliza¸c˜ao. Uma caracter´ıstica peculiar da tecnologia de cDNA ´e que nos experimentos realizados, os n´ıveis de express˜ao dos genes de duas amostras s˜ao avaliados simultane-

amente4_{. Neste sentido, geralmente, uma das amostras ´e proveniente de um tecido de}

interesse enquanto a outra ´e uma amostra de controle (Freeman et al., 2000).

O experimento propriamente dito tem in´ıcio com a extra¸c˜ao de mol´eculas de mRNA das duas amostras: interesse e controle. Como as mol´eculas de mRNA se degradam rapidamente e s˜ao relativamente inst´aveis, mol´eculas de cDNA (DNA complementar), mais est´aveis, s˜ao geralmente obtidas a partir das mol´eculas de mRNA para subsequente

utiliza¸c˜ao nos experimentos (Kuo et al., 2004). As mol´eculas de cDNA obtidas s˜ao ent˜ao

submetidas a um processo de marca¸c˜ao que permite sua posterior detec¸c˜ao no microarray. O cDNA proveniente da amostra de interesse ´e marcado com corante fluorescente vermelho (Cy5), enquanto que o cDNA proveniente da amostra de controle ´e marcado com corante fluorescente verde (Cy3). Uma vez marcadas, as mol´eculas de ambas amostras s˜ao ent˜ao depositadas sobre o mesmo microarray.

Com a deposi¸c˜ao do material gen´etico das duas amostras (cDNA obtido a partir das mol´eculas de mRNA presentes em cada uma das amostras), o processo de hibridiza¸c˜ao tem in´ıcio. Mol´eculas de cDNA de genes espec´ıficos se hibridizam, se ligam, ao seu

4

Em virtude desta caracter´ıstica, microarrays de cDNA s˜ao tamb´em conhecidos como double channel microarrays (Tarca et al.,2006).

DNA correspondente fixado em probes do microarray5_{. Como o material gen´etico das}

duas amostras (interesse e controle) ´e misturado e depositado simultaneamente, ambos participam do processo de hibridiza¸c˜ao simultaneamente. Ap´os um per´ıodo de tempo de- terminado, o array ´e lavado a fim de remover mol´eculas de cDNA que n˜ao hibridizaram, ou seja, que n˜ao se fixaram a nenhum probe ou que se fixaram apenas parcialmente a um probe que n˜ao corresponde ao seu gene. Dessa forma, o processo de lavagem pos- sui por finalidade limpar o array, deixando neste somente as mol´eculas de interesse que hibridizaram ao probe correto.

Uma vez lavado, o microarray ´e fornecido como entrada a um scanner que emite feixes de luz com comprimento de onda espec´ıfico para cada um dos corantes utilizados na prepara¸c˜ao das amostras. Como resultado, duas imagens s˜ao obtidas: uma para cada amostra analisada. Estas imagens s˜ao ent˜ao combinadas via software e resultam em uma ´

unica imagem, que possui trˆes cores (verde, vermelho e amarelo) em diferentes n´ıveis de intensidade, tal qual mostrado na Figura 3.2. S˜ao as cores da imagem final e suas intensidades que quantificam os n´ıveis de express˜ao dos genes analisados nas duas amostras submetidas ao experimento. A cor de cada probe determina em qual amostra o gene em quest˜ao ´e predominantemente expresso, enquanto sua intensidade revela o n´ıvel de express˜ao relativo do gene para as duas amostras. Tal colora¸c˜ao se deve aos corantes fluorescentes introduzidos inicialmente nas amostras biol´ogicas: vermelho na amostra de interesse e verde na amostra de controle. Como exemplo, considere a Figura 3.1(b) que resume a realiza¸c˜ao de um experimento de cDNA. A presen¸ca da cor vermelha no probe do gene X indica que aquele gene esteve mais expresso na amostra de interesse, ou seja, uma maior quantidade de material gen´etico da amostra de interesse hibridizou ao probe do gene em quest˜ao. A presen¸ca da cor verde no probe do gene Y indica que aquele gene esteve mais expresso na amostra de controle, ou seja, uma maior quantidade de material gen´etico da amostra de controle hibridizou ao probe em quest˜ao. J´a a presen¸ca da cor amarela no probe do gene Z indica que aquele gene esteve igualmente expresso tanto na

amostra de interesse quanto na amostra de controle6, ou seja, material gen´etico de ambas

as amostras (interesse e controle) hibridizaram em quantidades similares ao probe em quest˜ao. Por fim, pontos com ausˆencia de colora¸c˜ao correspondem a genes n˜ao expressos em nenhuma das amostras, ou seja, o gene do probe em quest˜ao n˜ao esteve expresso tanto na amostra de interesse quanto na amostra de controle.