Microrganismos utilizados

Os isolados de fungos ectomicorrízicos (fECM) utilizados neste trabalho foram provenientes de plantações de Pinus spp. e Eucalyptus spp., localizadas em Santa Catarina e Minas Gerais, e pertencem à coleção do LECM/MIP da UFSC. Foram utilizados 6 isolados de fECM dessa coleção, conforme indicado no Quadro 4.1. Chondrogaster angustisporus Giachini, Castellano, Trappe & Oliveira, é uma nova espécie encontrada no Brasil e na Austrália e descrita por Giachini et al. (2000). Essa espécie também foi encontrada mais

recentemente em plantios de eucalipto na Espanha (ALVAREZ e CERCEDA, 2005). A escolha desses isolados baseou-se em resultados de trabalhos anteriores realizados por membros do mesmo laboratório (ROSSI, 2001; NARLOCH, 2002; SOUZA, 2003; SOUZA et al., 2004, OLIVEIRA, 2004) nos quais verificou-se o desempenho desses isolados em colonizar o sistema radicular e promover o crescimento e absorção de P em mudas de E. dunnii e P.

taeda.

Os isolados foram mantidos por subcultura em meio MNM e PGK sólido (1,5% ágar) (Quadro 4.2), com repicagens mensais, e incubação na ausência de luz à temperatura de 25±1 °C.

Código Espécie Hospedeiro Local Ano da _coleta

UFSC-Sc42 Scleroderma sp. (Persoon) Fries Pinus sp. Blumenau-SC 1988

UFSC-Rh90 Rhizopogon nigrescens Coker & _Couch P. taeda Três Barras-SC 1993

UFSC-Rh106 Rhizopogon vulgaris (Vitt.) M. Lange P. taeda Três Barras-SC 1995

UFSC-Pt116 Pisolithus microcarpus (Cooke & Massee) _{G. Cunn.} E. dunnii Correia Pinto-SC 1997

UFSC-Ch163 Chondrogaster angustisporus Giachini,

Castellano, Trappe & Oliveira E. dunnii Correia Pinto-SC 1995

UFSC-Pt188 Pisolithus microcarpus (Cooke & Massee)

G. Cunn. Eucalyptus sp. Lavras-MG 1999

Quadro 4.1 Isolados de fungos ectomicorrízicos da coleção do LECM da UFSC.

4.2 Meios de cultura para os isolados fúngicos

Foram utilizados o meio MNM (MARX, 1969) e variações do meio PGK (ROSSI, 2001; ROSSI et al., 2002). A quantidade de nitrogênio do meio MNM, originalmente 0,25 g.L-1 (C/N 50/1), foi alterada para 0,75 g.L-1, pois Marx (1969) modificou a fonte de carbono e não corrigiu o nitrogênio, deixando o meio desbalanceado para aplicações em estudos de crescimento. Em diversas aplicações também se adicionou 0,2% de carvão ativo neutralizado no meio de cultura para placas. A composição desses meios é apresentada no Quadro 4.2, sendo denominados da seguinte forma:

ƒ MNM Meio de Melin-Norkrans Modificado (MARX, 1969);

ƒ PGK Meio Pridham-Gottlieb (LITCHFIELD e ARTHUR, 1983) com modificações propostas por KUEK (1996);

Componentes MNM (g.L-1)1 PGK (g.L-1) PGKM (g.L-1₎ Glicose 10,0 10,0 14,0 Peptona de soja - 3,33 5,00 Extrato de levedura - 0,67 - Extrato de malte 3,0 - 3,00 CaCl2 0,050 - - NaCl 0,025 - - NH4NO3 - 1,0 0,90 (NH4)2HPO4 0,75 - - NH2CONH2 - - 0,10 KH2PO4 0,50 0,264 0,264 K2HPO4 - 0,628 0,628 MgSO4.7H2O 0,15 0,330 0,330 CuSO4.5H2O - 0,0021 0,0021 MnCl2.4H2O - 0,0004 0,0004 ZnSO4.7H2O - 0,0006 0,0006 FeSO4.7H2O - 0,0005 0,0005 FeCl3 (solução 1%) 1,2 mL - - Tiamina-HCl 100µg - - Relação C/N 14/1 10/1 14,6/1

Quadro 4.2 Composição dos meios de cultura utilizados como base para os estudos de produção de biomassa.

Uma variação diluída do meio PGKM também foi utilizada, contendo (em g.L-1): glicose 10,0; peptona de soja 2,5; extrato de malte 1,5, e sais 70% da formulação. Na maioria das vezes os meios de cultura foram complementados com os micro-nutrientes apresentados no Quadro 4.3. Componentes Quantidade (g.L-1₎ Na2Mo4.2H2O 0,00200 H3BO3 0,00300 CoCl2.6H2O 0,00003 KI 0,00075 Quadro 4.3 Micro-nutrientes para complementação dos meios de cultura.

Nota:

Ao longo da apresentação serão mencionados muitas vezes os termos inóculo e inoculante.

Apesar de em essência ter o mesmo significado, o termo inoculante é utilizado aqui com propósito de designar um produto para inoculação de plantas, enquanto que inóculo é utilizado para designar a biomassa utilizada para inocular o meio de cultura.

1 _{Exceto para FeCl}

4.3 Condições de cultivo e de operação

Os fungos ectomicorrízicos não esporulam em cultura, mas somente através das frutificações (cogumelos), fazendo com que o inóculo para cultivo desses fungos seja constituído de uma suspensão de hifas. Como observado em estudos anteriores (ROSSI, 2001), as dificuldades para produção do inóculo desses fungos são maiores em shaker, além disso, no cultivo em meio líquido estático a biomassa cresce na superfície facilitando sua separação do extrato que normalmente é tóxico ao próprio fungo. A simplicidade, o menor risco de contaminação e o alto rendimento, fazem do cultivo estático uma ótima opção para produção do inóculo em pequena escala.

Devido à utilização de vários isolados e, principalmente, à falta de um sistema de controle do pH, neste trabalho não foram realizados estudos para otimização das condições de cultivo. Desse modo, o pH adotado foi aquele mais utilizado no cultivo desses fungos, e a temperatura foi a média que ocorre normalmente na região de Santa Catarina.

Como o cultivo dos fungos constituiu o ponto central desta proposta, são apresentadas abaixo as condições gerais utilizadas para tal fim:

1. Em placas de Petri: culturas incubadas em estufa tipo BOD a 25±1 o_{C, na ausência de luz.}

2. Em frascos: cultivo estático em incubadora BOD, à temperatura de 25±1 oC e na ausência de luz. Foram utilizados frascos de Erlenmeyer de 250 mL de volume com 25 mL de meio de cultura. Os fungos foram inoculados na forma de discos de micélio-ágar de 7 mm de diâmetro (5 a 8 discos por frasco), obtidos de culturas recentes (20 a 30 dias) em placas. 3. Em biorreator: processo em batelada, à temperatura de 25±1 oC e vazão de ar constante.

No biorreator de inox, o cultivo foi conduzido na ausência de luz, e no biorreator de vidro permaneceu exposto à luminosidade natural. Os fungos foram inoculados na forma de suspensão miceliana com concentração variando entre 0,20 e 0,50 g.L-1_.

4. O ajuste de pH nos meios de cultura, de regra em 5,8, foi realizado antes da esterilização e, dependendo do ensaio, com uma solução equimolar de ácido cítrico/citrato de sódio (A/C) 0,1 M (SMITH, 1982), com a função auxiliar de manutenção do pH, ou HCl/NaOH 0,1 M. Foi utilizado um potenciômetro padrão de bancada.

5. Nos cultivos em biorreator, foram utilizados 0,2 a 0,4 mL.L-1 do anti-espumante polipropilenoglicol.