Microscopia óptica

A microscopia óptica (ou luminosa) permite a visualização de células procarióticas (e de seus componentes) que não são visíveis a olho nu por apresentarem tamanhos diminutos compreendidos entre micrômetros e nanômetros (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

A função de um microscópio óptico é formar e ampliar a imagem de uma amostra a partir da incidência de luz, a qual passa por lentes objetivas e oculares, permitindo a visualização. Ainda, o microscópio aumenta o poder de resolução do olho humano (capacidade de distinguir dois pontos muito próximos um do outro), que é restrito à faixa de 0,1 a 0,2 mm (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

Dentre os tipos de microscopia na qual o aumento é obtido por um sistema de lentes que recebem um feixe de luz, estão a microscopia de contraste de fase e a microscopia de fluorescência, ambas utilizadas nesta pesquisa para examinar as amostras provenientes dos biometanizadores.

3.5.1.1 Microscopia de contraste de fase

A microscopia de contraste de fase foi inventada em 1.936 por Frits Zernike, um físico e matemático holandês, que utilizou como princípio a natureza das ondas dos raios luminosos e o fato desses raios poderem estar em fases (quando seus picos e vales combinam-se) ou fora de fase (MADIGAN et al., 2010; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).

Em um microscópio de contraste de fase, um conjunto de raios luminosos sai da fonte de luz e o outro conjunto provém da luz refletida ou difratada de uma estrutura particular na amostra. Quando os dois conjuntos de raios de luz (da fonte e refletido ou da fonte e difratado) são reunidos, a imagem da amostra é formada na lente ocular, contendo áreas que são relativamente claras (em fase), bem como intensidades de cinza até a cor negra, as quais estão fora de fase (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012). O resultado é uma imagem com graus variáveis de luminosidade, coletivamente denominados contrastes, que originam-se devido a presença de materiais com espessura ou densidade diferentes (quanto mais denso o material, mais clara será a sua imagem e vice-versa) (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

36 Pelo fato de não ser necessária a fixação da amostra na lâmina e de dispensar o uso de corantes, a microscopia de contraste de fase permite a observação de preparações à fresco (vivas), evitando-se procedimentos que poderiam matar os micro-organismos ou alterar suas características (MADIGAN et al., 2010).

3.5.1.2 Microscopia de fluorescência

Quando as espécies presentes na amostra são capazes de fluorescer (seja por serem autofluorescentes ou por serem tratadas com algum composto fluorescente), há a absorção de comprimentos de luz de ondas curtas (ultravioleta) e a produção de luz em um comprimento de onda maior (visível). Esta é a base da microscopia de fluorescência, na qual os micro- organismos emitem luz de uma cor quando iluminados com luz de outra cor (MADIGAN et al., 2010; TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).

A identificação de células e colônias metanogênicas pode ser realizada com o uso dessa microscopia, pois as arqueas produtoras de metano são autofluorescentes: possuem uma coenzima, a F420, que participa como doadora de elétrons em várias etapas da redução de CO2, e, quando oxidada, absorve luz na faixa de 420 nm e fluoresce na cor verde-azulada. Caso esteja na forma reduzida, a coenzima F420 torna-se incolor (MADIGAN et al., 2010; OREMLAND, 1988).

3.5.1.3 Informações obtidas com a microscopia óptica

A observação microscópica de um micro-organismo permite o conhecimento de sua morfologia grosseira, ou seja, obtêm-se informações sobre o tamanho, a forma e o arranjo celulares (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

De acordo com Madigan et al. (2010), ainda não se sabe como a morfologia de uma espécie é determinada, mas possivelmente é devido à ação de forças seletivas, como por exemplo:

 otimização da captação de nutrientes (determina se uma célula será pequena ou com elevada proporção entre superfície e volume);

 mobilidade natatória em ambientes viscosos ou próximos à superfícies (determina se as células serão helicoidais ou espiraladas);

37 Verifica-se que a morfologia não é apenas uma característica trivial da célula microbiana, mas sim uma característica geneticamente direcionada e evolutivamente selecionada para que a espécie adeque-se ao máximo a um hábitat particular (MADIGAN et al., 2010).

Tamanho

Os procariotos, em geral, apresentam dimensões médias de 1 X 2 µm, contudo, pode- se encontrar células muito pequenas, com diâmetro de aproximadamente 0,2 µm, até aquelas com diâmetro maior que 700 µm (MADIGAN et al., 2010). Comumente, os micro- organismos são visualizados pelo microscópio sob uma magnitude de 1.000 vezes (comparativavente, se uma mosca doméstica fosse vista sob a mesma magnitude, pareceria ter mais de 9 m de comprimento) (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

Uma propriedade decorrente do tamanho dos procariotos é a alta razão que apresentam entre área superficial e volume celular (quando comparados a organismos maiores de morfologia similar), ou seja, há uma grande superfície através da qual os nutrientes podem entrar em relação a um pequeno volume celular a ser alimentado. Essa particularidade explica, em partes, a alta taxa de metabolismo e crescimento dos micro-organismos, além de afetar seu processo evolutivo (PELCZAR JÚNIOR; CHAN; KRIEG, 1997).

A vantagem evolutiva de células com dimensões menores está no maior número de mutações que podem ocorrer durante a replicação do DNA, pelo fato de tais células crescerem mais rápido que células maiores, além de serem capazes de sustentar uma população maior com a mesma quantidade de recursos. Ainda, a rapidez de crescimento e de evolução está relacionada à expressão imediata das mutações nas células haplóides em detrimento das células diplóides (MADIGAN et al., 2010).

Forma e Arranjo

A forma de um micro-organismo é determinada por hereditariedade, entretanto, condições ambientais têm a capacidade de modificar a forma microbiana, dificultando sua identificação. A maioria dos procariotos é monomórfica (mantém uma única forma durante toda a vida), existindo algumas espécies que são geneticamente pleomórficas, como bactérias do gênero Corynebacterium (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).

No Quadro 6 são apresentadas as formas básicas mais comuns dos procariotos, bem como alguns agrupamentos originados a partir da divisão de tais formas.

38 Quadro 6– Formas básicas mais comuns e respectivos arranjos celulares apresentados por procariotos

FORMA ARRANJO Coco diplococo em cadeia tétrade sarcina irregular Bacilo diplobacilos em cadeia cocobacilos Espiralada vibrião espiroqueta

Fonte: adaptado de Tortora, Funke e Case (2012).

Conhecer a morfologia dos micro-organismos que participam da biometanização dos resíduos sólidos orgânicos é importante para o entendimento do processo, mas não é suficiente para prever propriedades celulares (fisiológicas, ecológicas, filogenéticas) que fornecerão informações para a otimização e controle do sistema.

Um exemplo da limitação da técnica microscópica é que a morfologia observada de uma Archaea bacilar é idêntica a de uma Bacteria bacilar, apesar de pertencerem a domínios filogenéticos distintos (MADIGAN et al., 2010). Contudo, o uso de técnicas moleculares pode superar tal entrave e complementar o estudo de imagem, pois baseia-se na análise direta do DNA amostral a partir da amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) de genes conservados que diferenciam, por exemplo, membros do domínio Archaea e Bacteria (VANWONTERGHEM et al., 2014).