Dentre todos os compostos de Rutênio avaliados na terapia do melanoma murino in vivo, o composto RuImSO4 foi, sem dúvida, o que apresentou melhores resultados e menores efeitos colaterais para os animais tratados. Este resultado nos surpreendeu, uma vez que a idéia inicial era testar os compostos de rutênio doadores de óxido nítrico e os compostos sulfatados funcionariam apenas como controle para os ensaios. Resolvemos, então, avaliar no composto sulfatado o que estaria interferindo com o desenvolvimento tumoral, se a atividade estava relacionada ao átomo metálico de Rutênio, ou ainda se os ligantes também tinham participação no efeito terapêutico do quimioterápico.
Para determinar o papel do ligante estabilizador desse complexo, realizou-se um ensaio in vitro, onde as células de melanoma murino B16F10-Nex2 foram incubadas com várias concentrações de imidazol (1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene, Sigma Aldrich). Após 24h, a viabilidade celular foi avaliada. O ligante Imidazol sozinho não foi capaz de reduzir a viabilidade das células tumorais murinas in vitro (Figura 9).
Para determinarmos o papel do átomo metálico de Rutênio na ausência de um grupamento sulfato no efeito antitumoral do composto RuImSO4, utilizou-se um derivado desse composto, onde o ligante de estabilização Imidazol foi substituído por um grupo trietilfosfito e o sulfato foi substituído por NO, o trans-Ru(NO)(NH3)4P(OCH2CH3)3 (representado na Figura 10A). O ligante trietilfosfito [P(OCH2CH3)3, ou P(OEt)3] é um composto organofosforado utilizado amplamente como ligante na química organometálica, e que se
degrada facilmente em dietil- e monofosfito. A característica mais marcante desse derivado trans-Ru(NO)(NH3)4P(OCH2CH3)3 é a extremamente rápida liberação do NO de seu sítio de coordenação e a entrada de uma molécula de água, devido à influência do ligante trietilfosfito presente. Desta forma, esse derivado em solução não contém o grupo sulfato, que foi substituído por uma molécula de água, e que foi denominado aqui de composto “Aquo”.
Em ensaio in vivo, o composto “Aquo” não foi capaz de interferir no desenvolvimento tumoral ou na sobrevida dos animais tratados, quando comparado aos animais tratados com PBS (Figura 10B), sugerindo que o átomo de Rutênio sozinho não apresenta o efeito terapêutico observado com o composto RuImSO4.
Animais tratados com o composto RuIsnSO4, onde o ligante de estabilização é o grupo isonicotinamida, na presença do grupo sulfato, apresentaram maior sobrevida e retardo no desenvolvimento tumoral nas 2 doses utilizadas, 50 e 100nmol (Figura 11).
Esses resultados em conjunto sugerem que o efeito terapêutico dos compostos sulfatados de Rutênio deve-se à estrutura química do composto, contendo o átomo de metal coordenado com os ligantes NH3, um ligante de estabilização inespecífico e um grupo sulfato.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Controle 1800 1000 500 180 18 2
númerode célulasviáveis(104)
Concentração(µM)
Imidazol
Figura 9: Viabilidade celular após tratamento com Imidazol in vitro.
Células B16F10-Nex2 foram incubadas na presença de diferentes concentrações de Imidazol (1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene, Sigma Aldrich). Controle, células não tratadas. Após 24h, a viabilidade foi avaliada utilizando o corante de exclusão Trypan Blue. p> 0,05 para todos os pontos comparados ao Controle.
Figura 10: O átomo metálico de Rutênio não é capaz de interferir no desenvolvimento tumoral in vivo. (A) Representação esquemática dos compostos de Rutênio envolvidos neste ensaio. (B) Sobrevida dos animais tratados com 100nmol/kg do composto Aquo ou PBS.
B A
Dias após o desafio
Sobrevida (%)
Dias após o desafio
Sobrevida (%)
H
2O
Figura 11: Efeito do composto RuIsnSO4 sobre animais desafiados com células de melanoma murino. Animais C57Bl/6 foram desafiados subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2. No dia seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuIsnSO4 ou PBS por 2 semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com 50nmol/kg do composto. (B) Animais tratados com 100nmol/kg do composto. Foram utilizados 10 animais por grupo. Estão representados o volume tumoral individual medido a cada 3 dias, como descrito em Materiais e Métodos, e a sobrevida dos animais, observada por até 60 dias.
B A
3000 2500 2000 1500 1000 500
0
3000 2500 2000 1500 1000 500
0 Volume tumoral (mm3)Volume tumoral (mm3)
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
Sobrevida (%)Sobrevida (%)
10 20 30 40 50 15 20 25 30 35 40 45 50
20 25 30 35 40 45 50 55 60 20 30 40 50 60
Dias após o desafio
Dias após o desafio
Dias após o desafio
Dias após o desafio
PBS RuIsnSO450nmol
PBS RuIsnSO450nmol
PBS RuIsnSO4100nmol
PBS RuIsnSO4100nmol
A análise morfológica por microscopia óptica, mostrada na Figura 1, sugere que as células tratadas com este composto estejam sofrendo um processo apoptótico, já que se observam alterações morfológicas significativas, com a manutenção das membranas celulares. Ensaios foram então realizados para determinar o tipo de morte celular que o tratamento com os compostos sulfatados estava induzindo, em colaboração com a Dra. Denise Arruda, Unidade de Oncologia Experimental, UNIFESP.
Primeiramente, foi realizado ensaio para marcação fluorescente com Anexina V e Iodeto de Propídio (PI), e leitura em citometria de fluxo. Neste ensaio, células apoptóticas apresentam marcação positiva para Anexina V, pois este marcador se liga diretamente à fosfatidilserina externalizada na membrana de células apoptóticas. A marcação com PI sugere processo necrótico, indicando que houve um aumento na permeabilidade da membrana com o corante entrando livremente e corando o núcleo das células. A dupla marcação caracteriza as fases finais do processo de morte celular. O gráfico da Figura 12 sugere que as células tumorais tratadas com o composto sulfatado RuImSO4
sofrem um processo de morte por apoptose, pois há um aumento expressivo das células marcadas com Anexina V, chegando a 12% após 12h de tratamento com o quimioterápico.
Analisando o núcleo das células tratadas com o composto sulfatado e coradas com o corante Hoechst 33342, observa-se que após 24h de tratamento com a dose correspondente ao IC50, as células de melanoma murino mostram-se com núcleos condensados (Figura 13). A contagem das células com este fenótipo demonstrou que na população estudada, aproximadamente 70% das células de melanoma murino tratadas com o
composto sulfatado apresentavam núcleos condensados como os mostrados na Figura 13.
Por fim, utilizou-se a metodologia de TUNEL para verificar o tipo de morte celular que o composto de rutênio sulfatado induziu nas células de melanoma murino. Neste ensaio, uma enzima específica que reconhece terminações de DNA (TdT) insere nucleotídeo fluorescente a cada terminação, o que faz com que a fluorescência seja proporcional à quantidade de fragmentos de DNA presentes em células submetidas a um estimulo apoptótico. Observou-se que as células tratadas com o quimioterápico apresentaram marcação positiva no ensaio, enquanto células não tratadas não apresentaram marcação (Figura 14).
Estes resultados sugerem que células de melanoma murino B16F10-Nex2 tratadas com o composto RuImSO4 entrem em processo de apoptose, como demonstrado pelas condensação nuclear, fragmentação do DNA e exposição de fosfatidilserina na superfície celular.
0 5 10 15 20 25
3h 6h 12h
C é lu la s p o si ti va s (% )
Anexina+
PI+
Anexina+ PI+
Figura 12: Marcação de Anexina e PI em células de melanoma murino B16F10-Nex2 após tratamento com composto RuImSO4. Gráfico representativo da porcentagem de células positivas para Anexina V e/ou PI, quantificadas em citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos.
B A
Figura 13: Alterações nucleares causada pelo composto RuImSO4. (A) Células B16F10-Nex2 murinas não tratadas e coradas com o corante Hoechst 33342. (B) Células B16F10-Nex2 tratadas durante 24h com RuImSO4 e coradas com Hoechst 33342. Metodologia descrita em Materiais e Métodos. Nota-se, ao centro, células com alterações nucleares (setas). Barra de aumento: 20µm.
Controle
RuImSO4
Fase Dapi TdT
Figura 14: Ensaio de TUNEL em células de melanoma murino B16F10-Nex2 tratadas com composto RuImSO4. Imagens representativas das células murinas tratadas ou não com RuImSO4 e submetidas ao ensaio de TUNEL, como descrito em Materiais e Métodos. Fase, visualização das células em microscopia de fase;
Dapi, células coradas com o corante nuclear Dapi; TdT, células após ensaio de TUNEL. Barra de aumento: 20µm