3 Parte Experimental
4 Resultados e Discussão
4.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A utilização da Microscopia Eletrônica de Varredura tem se tornado cada vez mais freqüente por fornecer informações detalhadas como, imagens de superfícies polidas e rugosas, orientação cristalina, diferenciação entre elementos [91]. Durante a fase de produção ou análise de materiais, sejam eles, poliméricos, cerâmicos, metálicos ou compósitos, quase sempre é necessário analisar sua morfologia.
A imagem eletrônica de varredura é formada pela incidência de um feixe de elétrons no material, sob condições de vácuo. Esta incidência promove a emissão de elétrons secundários, retroespalhados e absorvidos. Os elétrons secundários possibilitam a visualização da topografia da superfície, os retroespalhados fornecem imagens características da variação de composição [92]. A imagem eletrônica de varredura representa em tons de cinza o mapeamento e a contagem de elétrons secundários e retroespalhados emitidos pelo material analisado [93].
A MEV permite aumentos de até 3000 vezes ou mais para a maior parte de materiais sólidos [91]. Neste trabalho, as esferas ALG/ESC (figura 08) e ALG/ESC- CaCl2 (figura 09) foram analisadas com um aumento de 1000 vezes.
Figura 08 - Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de esferas ALG/ESC.
Ao comparar as micrografias eletrônicas das esferas ALG/ESC (figura 08) com as das esferas reticuladas com CaCl2, as diferenças são evidentes. As esferas
ALG/ESC apresentam um aspecto não uniforme, com deposição de aglomerados de partículas, com estrutura aparentemente hexagonal, característicos da hidroxiapatita presente na escama de peixe [01]. As esferas ALG/ESC-CaCl2 (figura 09),
adquiriram uma superfície com distribuição uniforme de partículas.
4.2.2 Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho
(FTIR)
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho é uma das técnicas mais utilizadas para a caracterização de biopolímeros. Na figura 10 estão apresentados os espectros da escama pura (ESC), do Alginato de Sódio (ALG) e dos materiais ALG/ ESC e ALG/ ESC-CaCl2.
Em todos os espectros de FTIR, observa-se uma banda larga e intensa entre 3000 e 3500 cm-1 que corresponde aos estiramentos dos grupos OH presentes no Alginato [61, 67] e na estrutura da hidroxiapatita [01]. No espectro de FTIR do ALG, uma banda em torno 1098 cm-1 esta presente devido ao estiramento C-O [60, 94]. Os picos em 1306 cm-1, 1412 cm-1 e 1606 cm-1 são característicos dos estiramentos do grupo, COO- [60, 61, 67, 95].
Nos espectros de absorção da ESC, é possível observar fortes bandas de absorção em 564, 605 e 1032 cm-1, correspondentes a diferentes modos vibracionais dos íons fosfatos na rede da hidroxiapatita [01, 60, 61, 67]. Os picos em 874 e 1418 cm-1 correspondem à ligação C-O dos grupos carbonatos incorporados na estrutura da apatita [01, 40, 60]. Também é possível observar bandas correspondentes às amidas I, II e III de colágeno tipo I. As amidas mostram uma banda de absorção da carbonila, conhecida como “banda de amida I”, sua posição depende do grau de ligação de hidrogênio e do estado físico do composto. As amidas primárias apresentam, em fase sólida, uma banda de amida I intensa em 1650 cm-1 correspondente às vibrações de deformação axial de C=O, o que está de acordo com o resultado encontrado neste trabalho, no qual esta banda foi observada em 1657 cm-1. As bandas da amida II evolvem o acoplamento da deformação de N- H com outras vibrações fundamentais que, nas amidas secundárias, no estado
sólido, aparecem entre 1570 e 1515 cm-1 [01, 42]. Com base nessas informações, atribui-se a banda observada em 1550 cm-1 no espectro da figura 10, à amida II. Nas amidas terciárias, uma banda de absorção mais fraca pode aparecer em torno de 1250 cm-1, resultante da interação entre a deformação angular N-H e da deformação axial C-N [40]. No espectro da escama esta banda chamada de “banda de amida III” aparece em 1242 cm-1.
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
1550 1242ALG/ESC-CaCl2
Reflectân
cia
564Número de Onda (cm-1)
1098 1030 1606 1412 1098 1032 1424 1306 1657 1636 605 1422ALG
ESC
ALG/ESC
Figura 10 - Espectros de absorção na região do infravermelho dos materiais ALG, ESC, ESC/ALG e
ALG/ESC - CaCl2.
No espectro do material ALG/ESC é possível observar que há a presença de alguns picos característicos do Alginato de Sódio e da escama, além de picos que indicam a interação entre ambos. Os deslocamentos dos picos referentes aos estiramentos assimétricos (de 1606 para 1636 cm-1) e simétricos (de 1412 para 1422 cm-1) do COO- para regiões de maiores comprimentos de onda, indicam a existência
da interação química entre íons Ca(II) da hidroxiapatita e o grupo carboxilato do alginato [60, 61]. É possível observar o desaparecimento da banda em 1306 cm-1 referente ao COO-, e das bandas em 564 e 605 cm-1 atribuída aos íons fosfato presentes na hidroxiapatita.
O espectro do material ALG/ESC-CaCl2 apresenta uma banda em 1098 cm-1
que é atribuída ao estiramento C-O é consideravelmente mais estreita devido às ligações cruzadas com os íons Ca(II). Isso acontece provavelmente devido à tensão do grupo carboxilato que aumenta para acomodar a estrutura de coordenação em torno dos íons Cálcio [60]. A banda em 1412 cm-1 tem sua intensidade reduzida quando comparada à amostra de Alginato de Sódio e é deslocada para um número de onda maior, 1424 cm-1, devido à presença do Ca(II)[95]. É possível perceber um aumento da intensidade da banda em 605 cm-1 e o desaparecimento do pico em 564 cm-1 que são atribuídas aos íons fosfato presentes na hidroxiapatita. Essas diferenças observadas indicam que houve de fato a formação de um novo material.
4.2.3 Difração de Raios X (DRX)
A análise de DRX é uma técnica de caracterização importante para determinar as diferentes substâncias e fases cristalográficas presentes, assim como os parâmetros de rede da célula unitária, identificar a cristalinidade do material além de determinar os espaços interlamelares.
Os raios X são produzidos quando elétrons são acelerados a partir do cátodo (um filamento de tungstênio) e atingem o ânodo metálico (CuKα, λ= 1,5418 Å), mantido em um alto potencial. A maior parte da energia dos elétrons é dissipada como calor. A desaceleração dos elétrons ao penetrar na amostra é o processo mais importante na produção de raios X [92]. Como resultado se obtém um espectro com picos que podem ser associados às distâncias interplanares das fases presentes. O difratograma obtido pode ser então comparado com os padrões difratométricos de fases individuais disponíveis no ICDD (International Center for Diffraction Data).
Os difratogramas de raios X dos materiais ALG, ESC, ALG-ESC e ALG/ESC- CaCl2 podem ser visualizados na figura 11. O DRX das esferas de Alginato de Sódio
apresenta dois halos característicos em 2θ igual a 110
ALG/ESC os halos em 110 e 200 estão presentes, porém em menor intensidade. No difratograma de ALG/ESC-CaCl2 ocorre total desaparecimento dos halos.
O padrão de DRX da escama pura apresenta um halo por volta de 20,0º e reflexões largas, correspondentes aos ângulos na escala 2θ iguais a 25,85º e 31,96º. Os picos obtidos foram comparados com os padrões de DRX armazenados no banco de dados cristalográficos para compostos cristalinos, ICDD. As reflexões em torno de 25,7 º e 31,8 º são correspondentes à fase cristalina da hidroxiapatita e o halo em 22,38 º é possivelmente atribuído à matéria orgânica, colágeno do tipo I, existente nas escamas [02]. Os picos de difração largos observados no padrão de DRX indicam que os cristais são pequenos, apresentam baixa cristalinidade ou estão estruturalmente desordenados, ou os três casos [01].
10 15 20 25 30 35 40 45 50
*
2(Graus).
*
*
*
*
.
.
ALG/ESC ESC ALG/ESC-CaCl2 IN T E N S ID A D E ALG Hidroxiapatita Colágeno.
Figura 11 - Padrão de DRX dos materiais ESC, ALG, ALG/ESC E ALG/ESC-CaCl2.
Nos difratogramas das esferas ALG/ESC E ALG/ESC-CaCl2 é possível
observar que houve um aumento no grau de cristalinidade, comparando com os materiais precursores ALG e ESC. No padrão de DRX das esferas ALG/ESC ocorre o aparecimento de um pico de baixa intensidade em torno de 20,63º que pode ser atribuído ao colágeno presente na escama, apesar de no difratograna do material ESC, esse pico não ter sido identificado. Isso ocorreu, provavelmente, pela presença
de uma região amorfa intensa em ALG e ESC. Para os híbridos ALG/ESC e ALG/ESC-CaCl2 é possível perceber a definição do halo em 27,23º atribuído ao
colágeno e o aumento na intensidade do pico em 31,96º, além de um pico não identificado em 45,37º. Esse aumento parece estar relacionado com o reordenamento da estrutura polimérica do Alginato, após a inclusão dos íons Ca(II), durante o processo de reticulação, além da acomodação da estrutura da hidroxiapatita no híbrido.
Os valores dos espaçamentos interplanares (dhkl) foram calculados utilizando
a equação (01), que descreve a Lei de Bragg [98].
dSen
n
2
(equação 01) onde n representa a ordem da reflexão e que pode ser qualquer numero inteiro (1,2,3,...), neste trabalho foi 1; λ é o comprimento de onda da radiação usada, neste trabalho foi λ= 1,5418 Å, correspondente à radiação Cuκα; d é o espaçamento interplanar (é função dos índices de Miller hkl) e θ é o ângulo de incidência da radiação com a superfície. Os valores das distâncias interplanares calculados para a escama pura, ESC, são 0,344 e 0,280 nm, para o material ALG/ESC são 0,430; 0,327; 0,283 e 0,200 nm e para o híbrido reticulado ALG/ESC-CaCl2 0,327 e 0,283nm.
Substituições na estrutura da hidroxiapatita podem alterar a cristalinidade, os parâmetros de rede, as dimensões dos cristais além de alterações nas distâncias interplanares. Pressupõe-se que a incorporação da hidroxiapatita através da troca iônica pode ter ocorrido com muita intensidade causando mudanças significativas na estrutura do polissacarídeo, alterando assim os padrões de difração [57, 96, 97]. No entanto, pode-se admitir que, além da troca iônica, outros mecanismos como interações eletrostáticas entre o Alginato e a escama podem ter ocorrido para formação dos híbridos ALG/ESC e ALG/ESC-CaCl2.
4.2.4 Termogravimetria
Métodos térmicos de análise, como a termogravimetria (TG), podem ser utilizados como uma técnica para monitorar mudanças físicas e químicas em polímeros e compósitos de origem natural ou sintética. Esta técnica produz curvas que é possível analisar a variação da massa de uma amostra durante certo tempo enquanto faz-se variar a temperatura segundo uma taxa de aquecimento [93]. Essa variação de massa pode resultar da ruptura ou da formação de diferentes ligações físicas e/ou químicas a altas temperaturas conduzindo a liberação de produtos voláteis.
As curvas de TG e DTG dos materiais ALG, ESC, ALG/ESC e ESC / ALG- CaCl2 são mostradas na figura 12.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 20 40 60 80 100 P e r d a d e m a s s a ( % ) Temperatura(ºC) ALG ESC ALG/ ESC ALG/ ESC/ CaCl2
0 100 200 300 400 500 600 700 800 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 D T G ( % / 0 C ) Temperatura(ºC) ALG ESC ALG/ ESC ALG/ ESC/ CaCl2
Figura 12 - Curvas de TG e DTG dos materiais ALG, ESC, ALG/ESC e ALG/ESC-CaCl2.
Os grupos carboxilato e hidroxila presentes na estrutura do Alginato são responsáveis pelas fortes interações com as moléculas de água. Assim, a dificuldade de remoção destas moléculas de água varia dependendo do grau de interação com o biopolímero. O Alginato apresenta dois estágios de degradação, o primeiro ocorre em temperaturas inferiores a 100ºC, com um máximo em 65ºC,
atribuído à água livre no material, que em perda de massa representa aproximadamente 6%. Na segunda etapa ocorre uma perda de massa de 65%, a partir de 190ºC apresentando um pico máximo em 243ºC, que corresponde à perda de água que está mais fortemente ligada à estrutura através de interações polares com os grupos carboxilato.
Para as escamas, foram identificados dois estágios de degradação: O primeiro, entre 30 e 200ºC, corresponde à perda de 11% em massa atribuída à água presente no material. O segundo, de 200 a 590ºC está relacionado à perda de matéria orgânica, ou seja, decomposição das fibras de colágeno, que representa em massa 32%. O resíduo de 57% em massa corresponde à matéria inorgânica presente nas escamas [01, 40].
A primeira etapa de degradação do híbrido ALG/ESC ocorre entre 30 e 200ºC com um máximo em 153ºC (12% em massa). A segunda etapa de perda de massa ocorre entre 133 e 345ºC com um máximo em 173ºC (48% em massa). Essas variações em áreas ou posições dos picos relacionados à perda de água indicam mudanças físicas ou moleculares causadas por modificações no polissacarídeo [98]. O material ALG/ESC-CaCl2 apresentou três estágios de degradação. O
primeiro ocorre entre 60 e 246ºC apresentando um máximo em 177ºC. A segunda etapa de perda de massa ocorre entre 246 e 326ºC e um máximo em 282ºC. O terceiro estágio inicia-se em 391 até aproximadamente 550ºC, com um máximo em 441ºC.
Como já esperado, o material hibrido reticulado com CaCl2 apresenta-se mais
estável termicamente quando comparado com ao Alginato (ALG), escama e ALG/ESC. Na tabela 01 são apresentadas as temperaturas máximas para cada estágio de degradação, obtidas a partir das curvas de DTG dos materiais ESC, ALG, ALG/ESC e ALG/ESC-CaCl2.
Tabela 01 - Temperaturas máximas de degradação dos materiais ALG, ESC, ALG/ESC, ALG/ESC-
CaCl2.
Material
Temperatura Máxima de Degradação (oC)
1º estágio 2º estagio 3º estágio
ALG 65 243 -
ESC 59 334 -
ALG/ESC 153 173 -
ALG/ESC-CaCl2 177 282 441
A alta estabilidade do material híbrido quando comparado aos materiais ESC, ALG, ALG/ESC, pode ser atribuída à formação da estrutura “caixa de ovos” como mostrado na figura 13, que favorece maior estabilidade ao híbrido.
O mecanismo de formação do gel de Alginato pode ser explicado pelo modelo “caixa de ovos”. De acordo com este modelo, os íons cálcio representam os ovos dispostos nos espaços que existem entre os blocos G emparelhados, que fazem o papel de caixa. As regiões de blocos G são alinhadas lado a lado, resultando na formação de uma cavidade, onde os íons cálcio fazem a junção entre as cadeias formando uma rede tridimensional [62, 90]. Quando as regiões do bloco G das cadeias poliméricas se aproximam na presença de íons divalentes, como Ca(II), uma estrutura dimérica é formada e os íons localizam-se nos interstícios entre as cadeias do Alginato, interagindo com o ânion carboxilato e com os grupos hidroxila [63].
O O O
O
OH O HO
O
- O O OO
O
O
O
- Ca2+Figura 13 - Esquema mostrando a interação dos blocos G na presença de íons Ca(II), de acordo com
o modelo “caixa de ovo”. Os círculos pretos representam os átomos de oxigênio envolvidos na coordenação do cátion.
O processo de gelificação do Alginato é baseado na afinidade do mesmo em relação a certos íons e na habilidade para estabelecer a ligação desses íons seletivamente e cooperativamente. A ligação seletiva dos íons Ca(II) está diretamente relacionada ao conteúdo de blocos G, ou mais precisamente, ao comprimento destes blocos. O aumento das ligações iônicas e, portanto, da rigidez mecânica, é verificado em Alginatos com alto conteúdo de blocos G [62, 63, 90].