Na Figura 46 são apresentadas micrografias do scaffolds X/no/Q*.
Figura 46: Micrografia da seção transversal do scaffold X/no/Q*, (A) micrografia de menor magnificação
mostrando as camadas presente no scaffold e sua seção transversal e (B), (C) e (D) micrografias obtidas com maiores aumentos na seção transversal do scaffold.
Nas micrografias do scaffold X/no/Q* (Figura 50) observa-se regiões densas e regiões pororas, com poros de tamanhos variáveis e apresentando dimensões menores que 1 μm.
Figura 47: Micrografias da seção transversal do scaffold e X/no/Q**. (A) Região onde observa-se toda
à seção transversal do material e (B), (C) e (D) imagens apresentando maior magnificação da seção transversal do scaffold, nas quais pode-se observar com mais detalhes a morfologia do material.
Nas micrografias da Figura 47 verifica-se que foi produzido um material muito poroso, com poros de tamanhos variáveis e interconectados entre si. Os poros notados nas micrografias do scaffold X/no/Q**, são maiores que aqueles observados para o scaffold X/no/Q* (Figura 51). O scaffold X/no/Q** apresentou poros na ordem de 0,5 - 4,8 µm.
Analisando as Figuras 46 e 47 em conjunto, pode-se inferir que o valor do pH influenciou na morfologia dos scaffold. O intumescimento em água deionizada proporcionou a formação de um material mais poroso, com poros maiores e interconectados (Figura 51). Ao fazer a imersão do filme X/no/Q em água, ocorreu oscilação do valor do pH, que diminuiu pelo fato da água não ter função tamponante. Esse evento fez com que a quitosana, que apresenta pKa 6,4, apresenta-se seus grupos aminos protonados e alguns grupos funcionais da xantana mativessem carregados e outros fossem neutralizados. Nessas condições houve a difusão de moléculas de água para o filme, de modo a hidratar esses grupos carregados. Isto gerou maior mobilidade das cadeias dos polissacarídeos e proporcionou o intumescimento do filme.
Em tampão Tris-HCl, apresentando valor de pH 7,4, os grupos aminos da quitosana estavam desprotonados, e a xantana apresentava alguns grupos funcionais carregados, como nesse pH a quantidade de cargas se mostrava menor, o intumescimento também foi inferior.
Como apresentado nos testes de intumescimento e também no teste de solubilidade, os filmes densos se apresentaram mais instáveis e solubilizaram mais em solução acetato (pH 3,8). Ao comparar o intumescimento em água com o intumescimento feito naquele tampão, nota-se que além do discutido anteriormente, a redução no valor de pH promoveu uma parcial solubilização do filme e, isto, proporcionou a formação de um material mais poroso e com poros de maiores dimensões.
As micrografias do scaffold X/↓Min/Q/X/Q^* são mostradas na Figura 48.
Figura 48: Imagem da seção transversal do scaffold X/↓Min/Q/X/Q^* sendo (A) micrografia de menor magnificação apresentando toda seção transversal e (B) região de maior magnificação da região central observada em (A), (C) refere-se a maior magnificação da região superior da figura (B) e (D) refere-se a maior magnificação da região inferior da figura (B)
Nas micrografias da Figura 49 são observados poucos poros (Figura 48 D), e, embora não tenha sido formado um material poroso, nota-se que houve mudança na morfologia do filme X/↓Min/Q/X/Q^ após o intumescimento (avaliar a
Figura 36 novamente). Após o intumescimento, o material X/↓Min/Q/X/Q^* tornou-se menos homogêneo que o filme X/↓Min/Q/X/Q^, não foi possível distinguir com facilidade suas camadas. Como esse material X/↓Min/Q/X/Q^* não apresentou a formação de uma grande quantidade de poros e poros interconectados e de acordo com a definição de scaffold, apresentada na Introdução desse trabalho, referir-se a esse material como scaffold não seria adequado, portanto seria melhor chamá-lo de filme X/↓Min/Q/X/Q^*,
A Figura 49 apresenta micrografias da seção transversal do filme X/↓Min/Q/X/Q^**.
Figura 49: Micrografias da seção transversal do scaffold X/↓Min/Q/X/Q^**. A imagem (A) mostra toda
seção transversal do scaffold, (B) apresenta maior magnificação da região central do lado direito na Figura A, (C) apresenta maior aumento da região indicada com a seta azul na figura B, (D) mostra uma região obtida com maior magnificação da figura C, onde é possível observar poros com menores dimensões.
Analisando a Figura 49 nota-se que o scaffold X/↓Min/Q/X/Q^** apresentou morfologia bastante porosa. Nas suas micrografias pode-se observar regiões com poros variando entre 20 µm à 100 μm (Figura 49 A e B) e outras regiões com poros menores (Figura 53 C e D). Além disso, há algumas regiões assemelhando a uma rede como pode ser observado nas regiões inferiores das Figuras 49 A e B.
Pela análise dos resultados anteriores observa-se que o intumescimento feito com água deionizada foi bastante eficiente na formação de scaffolds, tanto quando foi intumescido o filme X/no/Q (Figura 46) quanto quando foi intumescido o filme X/↓Min/Q/X/Q^ (Figura 53).
A solução tampão Tris-HCl não foi eficiente na formação de scaffolds, o que pode ser justificado pelo seu pH 7,4 e pelo que já foi discutido anteriormente para o scaffold X/no/Q*. Além disso, a mineralização do filme X/↓Min/Q/X/Q^ o tornou menos suscetível ao intumescimento. A mineralização promoveu a formação de um maior número de interações no filme. Nesse filme os íons Ca2+ agiram reticulando a xantana, a partir da complexação deles com os grupos carboxílicos do polissacarídeo, (Bueno et al., 2014; Maity & Sa, 2014; Venkatesan et al., 2014; Yokoi et al., 2013). E também, como visto na literatura, eles podem formar complexos com os grupos aminos da quitosana (quitosana-NH2...Ca2+) e consequentemente, podem atrair cargas negativas, como íons fosfatos (Li, et al., 2011). O somatório de todas essas interações e daquelas existentes entre os polissacarídeos, dificultaram o intumescimento do filme X/↓Min/Q/X/Q^*, em solução tampão Tris-HCl, o que não foi observado, nessas mesmas condições de estudo, para o filme X/no/Q.
9.4 Análise de Microtomografia computadorizada (Micro-CT)
Amostras do filme X/↓Min/Q/X/Q^ e scaffold X/↓Min/Q/X/Q^** foram caracterizadas por análise de Micro-CT e as imagens obtidas são apresentadas na Figura 50 A, B, D e E. Na Figura 50 C é apresentada a escala de cores utilizada para representação de cada tipo de elemento nas micrografias. Na escala de cores, Figura 50 C, quanto mais nos aproximamos das cores da direita (de tonalidade azul) maior é a atenuação de raios X. As cores que representam os minerais são aquelas de tonalidade azul, ou seja, elementos que atenuam mais raios X e podem ser associados aos elementos que possuem maior densidade eletrônica. As cores de tonalidade vermelho/alaranjado são relacionadas aos elementos que atenuam menos raios X e que devem apresentar menor densidade eletrônica, ou seja, são atribuídas aos polissacarídeos. Nas Figuras 50 D e E, são apresentadas imagens em três dimensões que foram reconstruídas a partir de imagens em duas dimensões como as da Figura 50 B, para o scaffold X/↓Min/Q/X/no/Q^**.
Figura 50: Imagens obtidas por Micro-CT para o filme (A) X/↓Min/Q/X/no/Q^ e o scaffold (B)
X/↓Min/Q/X/no/Q^**. Em (C) é apresentada uma escala de cores utilizada para as análises de MicroCT. As figuras D e E são imagens em 3 dimensões reconstruídas a partir de imagens em 2 dimensões como as da figura B, para o scaffold X/↓Min/Q/X/no/Q^**.
Analisando as Figuras 50 A e C para o filme X/↓Min/Q/X/Q^ nota-se que a presença de quatro camadas em azul e três regiões em vermelho/alaranjado (Figura 50 A). Na imagem da Figura 50 são observadas regiões de tonalidade azul nas extremidades do filme, nesse caso, essas observações podem ser relativas a um artefato da técnica, por não ter conseguido distinguir componentes apresentando densidades próximas, não obtendo uma análise precisa para essas regiões. Pela ordem de preparo do filme, estas regiões deveriam ser associadas aos polissacarídeos e não aos minerais. Se essas regiões fossem associadas aos minerais, na Figura 50 B, correspondente à amostra do scaffold X/↓Min/Q/X/no/Q^**, seria visto uma grande região apresentando tonalidade azul e isso não é observado.
Pela análise da Figura 50 B nota-se que o material é bastante poroso. É observada que a distribuição de coloração pelo scaffold é homogênea, mas em algumas regiões é observado maior atenuação da cor azul. A mineralização ocorreu por todo o material e não apenas entre as camadas de xantana/quitosana como era esperado, entretanto em algumas regiões há maior concentração de minerais. Tal resultado pode ser explicado pela interação de íons Ca2+ e HPO42- não apenas com
os grupos funcionais de xantana, mas também com os grupos funcionais da quitosana.
Nas Figuras 50 D e E, que são imagens em 3D é verificado que o scaffold apresenta muitos poros e que eles são interconectados, portanto, verifica-se que foi formado um material que pode ser um possível candidato no uso como scaffold, funcionando como um arcabouço para o crescimento celular de células ósseas.
A presença de grande quantidade de poros no scaffold X/↓Min/Q/X/no/Q^**, juntamente com a interconectividade dos mesmos, torna esse material promissor candidato como para reconstituição de ossos. A presença de poros e sua interconectividade pode facilitar a migração e multiplicação celular e também a nutrição dos tecidos e, portanto, podem favorecer a regeneração do tecido ósseo.