A saliva é usada como fluído de biópsia líquida em diversos campos científicos, incluindo doenças orais. (96) A saliva é considerada um filtro do sangue, o que explica a presença na saliva de moléculas circulantes no sangue. A análise deste fluído é uma oportunidade para detetar biomarcadores associados com o início e o desenvolvimento do cancro oral. (97) (98) Adicionalmente, as vantagens de uso da saliva como meio de diagnóstico incluem a simplicidade, o facto de não ser um método invasivo e ser relativamente económico.
Diversos microRNAs apresentaram-se desregulados em diversos estudos de COCE (Figura 23). (99) (100) (101) (92) (19) (102)
Figura 23 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares com utilidade no diagnóstico do
37
Uma variedade de miRs adicionais salivares foram igualmente pesquisados na tentativa de os confirmar como biomarcadores de diagnóstico de cancro oral (Figura 24). (103) (104)
Figura 24 - Ilustração de microRNAs salivares desregulados.
Rapado-Gonzáles e colaboradores realizaram uma meta-análise, em 2019, com o objetivo de avaliar a exatidão do uso de miRNAs presentes na saliva e no sangue como identificadores de COCE nos estadios iniciais. 22 miRNAs presentes em biópsias líquidas estavam desregulados e os miRNAs sanguíneos e salivares evidenciaram uma exatidão de 91% no diagnóstico precoce do COCE. Esta meta análise confirmou a importância clínica, estatisticamente significativa, destas biomoléculas na deteção inicial do cancro oral. (105)
Um outro estudo, analisou a expressão diferencial de miRNAs na saliva de pacientes com neoplasias malignas da parótida comparativamente a pacientes com neoplasias benignas desta glândula. Nove miRNAs estavam mais sobre-expressos em pacientes com cancro da parótida relativamente aos de pacientes com tumores benignos. De entre estes nove, quatro miRs (miR-
132, miR-15b, miR-140 e miR-223), quando pesquisados em combinação, apresentaram
potencial discriminatório entre amostras salivares de tumores malignos da parótida versus tumores benignos (sensiblidade de 69% e especificidade de 95% com AUC de 0.90). Apesar dos resultados apresentarem caráter preliminar, são promissores relativamente à aplicabilidade dos miRNAs no diagnóstico precoce de cancro das glândulas salivares. (106) (107)
A utilidade do uso de miRNAs salivares como biomarcadores de controlo da transformação maligna de lesões orais foi demonstrada no estudo de Yang e colaboradores. Leucoplasias orais com semelhanças histopatológicas mas com diferentes características clínicas, foram analisadas. Perfis de expressão de determinados miRs foram detetados em leucoplasias de baixo
38
grau com posterior progressão para o elevado grau e até em carcinoma in situ ou COCE. A maioria de miRNAs desregulados nas leucoplasias de baixo grau progressivas foram os mesmos identificados nos casos com COCE (sub-regulação do let-7, miR-145, miR-99 e sobre-regulação
do miR-708, miR-10b, miR-26a e miR-30e). O miR-181c e miR-181b estavam sub-expressos
em leucoplasias progressivas e sobre-expressos em leucoplasias não progressivas. Isto sugere que determinados miRNAs, nomeadamente a família miR-181 (miR-181a/b/c/d), atuam como oncogenes ou supressores tumorais dependendo do tipo tecidular. Uma das conclusões do estudo foi a aplicabilidade potencial de miRNAs salivares na deteção não invasiva de lesões orais pré-malignas e uma melhoria no diagnóstico histológico das mesmas. (85)
A capacidade de diagnóstico dos miRNAs estende-se à deteção das lesões orais pré-malignas e à predição da transformação maligna destas lesões como no caso do Líquen Plano Oral (LPO) (Figura 25). (97)
Figura 25 - Esquema ilustrativo dos microRNAs salivares detetados em pacientes com LPO.
A tabela III inclui miRNAs úteis no diagnóstico do cancro oral.
Tabela III - MicroRNAs reportados por apresentarem concentrações desreguladas nos fluídos
corporais, relevantes para o diagnóstico do cancro oral.
miRNA(s) Desregulação Fonte da amostra Referências
miR-181 Sobre-regulação Plasma (6)
miR-196a Sobre-regulação Plasma (6)
miR-191 Sobre-regulação Saliva (7)
miR-203 Sobre-regulação Saliva (7)
39
miR-34a Sub-regulação Sangue e Saliva (22)
miR-16 Sobre-regulação Soro (78)
miR-9 Subre-regulação Soro e Saliva (108)
miR-92a Sobre-regulação Soro (78)
miR-25 Sobre-regulação Soro (78)
miR-195 Sobre-regulação Soro (78)
miR-624 Sobre-regulação Soro (78)
miR-331-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-603 Sobre-regulação Plasma (109)
miR-1303 Sobre-regulação Plasma (109)
miR-660(-5p) Sobre-regulação Plasma e Saliva (109)
miR-212-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-194-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-214-3p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-335-5p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-18a-5p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-205-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-192-5p Sub-regulação Plasma (109)
miR-150-5p Sub-regulação Plasma (78)
miR-601 Sub-regulação Plasma (109)
miR-375 Sub-regulação Plasma (110)
miR-187 Sobre-regulação Plasma (111)
miR-200b-3p Sobre-regulação Plasma (78)
miR-134 Sobre-regulação Plasma (78)
miR-372 Sobre-regulação Plasma (78)
miR-19a Sobre-regulação Soro (78)
miR-148a Sobre-regulação/Sub-
regulação
Plasma/Saliva (104)
miR-451 Sobre-regulação Soro e Saliva (112)
miR-3651 Sobre-regulação Soro (113)
miR-483-5p Sobre-regulação Plasma (109)
miR-486-5p Sobre-regulação/Sub-
regulação
Soro/Plasma (95) (110)
miR-197 Sub-regulação Saliva (85)
7.Discussão
O cancro oral mais frequente é o COCE. A sua frequência mundial significativa (2-4%) e mau prognóstico, se não for detetado precocemente, tornam importante a sua investigação. (114) (115)
40
Consequentemente, grande parte dos estudos e investigações dedicam-se a este tipo de cancro oral. O COCE apresenta grande heterogeneidade intra e inter-tumoral e torna-se mais agressivo ao longo do tempo. As estratégias de diagnóstico precoce do cancro oral estão consequentemente em constante evolução. (116) (117)
Nas últimas décadas diversas técnicas de biologia molecular promoveram uma nova compreensão acerca das vias genéticas e moleculares na base oncológica. E, como tal, surgiram novos meios auxiliares no diagnóstico precoce do cancro oral. É o caso dos MicroRNAs que regulam até 30% de todos os genes exercendo as suas ações como oncogenes ou supressores tumorais. Adicionalmente apresentam estabilidade na sua expressão e são de fácil acesso. Os miRNAs têm a capacidade de diferenciar os subtipos de cancro por apresentarem padrões de expressão específicos. (118)(119) (120) (7)
A descoberta dos microRNAs representou, assim, uma nova ferramenta auxiliar no diagnóstico do cancro oral. No entanto, existem ainda muitos aspetos mal elucidados, tais como, a quantidade de microRNAs que está realmente envolvida na carcinogénese, o número total de genes-alvo para cada um desses microRNAs, a variabilidade de expressão dos miRNAs segundo a localização do tumor, o grau histológico deste e a presença de expressões contraditórias do mesmo miRNA em grupos populacionais diferentes. (121) (122)É, por isso, necessário, além de outras medidas, formular protocolos standard de análise destes biomarcadores de forma a melhorar a reprodutibilidade dos resultados. (78)
Neste contexto, os investigadores têm desenvolvido técnicas mais inovadoras de deteção destas biomoléculas tendo como objetivo melhorar a especificidade das técnicas mais convencionais, como a PCR.(123)Os sistemas imagiológicos recentes de deteção dos miRNAs, também não requerem manipulação complexa das amostras e permitem estudos in vivo. No entanto, estas novas gerações, apresentam desvantagens porque necessitam de modificações genéticas em indivíduos estudados, para exercer as suas funções de deteção. Exigem igualmente equipamentos mais recentes, limitando, assim, o seu uso na prática clínica. (45)
No contexto da inovação, numerosos miRNAs desregulados foram detetados na saliva e no sangue de pacientes com cancro oral, recorrendo à biópsia líquida. As vantagens deste método são a estabilidade e resistência à degradação dos miRNAs e a classificação dos padrões de expressão dos miRNAs que corresponde à classificação clinico-patológica do tumor. (107) (124)
41
Contudo, desafios persistem. As infeções contribuem à desregulação da expressão dos miRNAs e os miRNAs circulantes usados na biópsia líquida, podem originar-se de outras células, além das tumorais. A comunidade científica deve construir protocolos com resultados reprodutíveis, quando são analisadas amostras idênticas, entre diversos laboratórios. Assim são necessários métodos “standard” na colheita de amostras, armazenamento e isolamento dos miRNAs, na sequenciação e na avaliação de dados. Adicionalmente, é necessário determinar o fluído corporal mais adequado (saliva vs sangue/plasma) para a análise dos miRNAs. (107)
Alguns estudos mencionaram que a saliva, por ser fácil de usar, de aceder, de contactar com as células da mucosa oral e de apresentar grupos específicos de miRNAs, permanece um dos fluídos corporais mais adequado para ser usado na biópsia liquida. Porém, as limitações como a heterogeneidade temporal, tumoral, a variabilidade intra e inter-paciente, o preço das tecnologias de análise e de deteção e ausência de protocolos standard, persistem. (125) (102) (126) Novos horizontes devem ser investigados de forma a atribuir informação estável e segura ao médico, com base nos miRNAs e na sua aplicabilidade no diagnóstico precoce do cancro oral.
A contínua investigação de tecnologias de sequenciação, deteção e quantificação dos microRNAs terá como desfecho mais provável um aumento da nossa compreensão e conhecimento acerca do papel destas biomoléculas no cancro oral. Auxiliará igualmente a deteção precoce e diferencial das neoplasias orais. Auxiliará igualmente a deteção precoce e diferencial das neoplasias orais. O grande desafio consistirá, sobretudo, na escolha do método de deteção e do material de biópsia mais adequados para determinados microRNAs e cancros orais. Dito isto, será razoável afirmar que os miRNAs, hoje em dia, permanecem como potencial ferramenta auxiliar no diagnóstico precoce do cancro oral. Contudo, os exames clínico e histopatológico continuam a ser os métodos de escolha para o diagnóstico de neoplasias malignas orais.
8.Conclusão
Nesta revisão bibliográfica, foram sumarizados os diferentes aspetos da contribuição dos miRNAs para o diagnóstico do cancro oral.
42
Diversos estudos demostraram o papel dos miRNAs nas vias celulares do cancro oral. No entanto, estudos futuros são necessários para descobrir vias novas. A desregulação dos miRNAs é um fator de risco significativo de desenvolvimento de cancro oral. De forma a se alcançar um maior controlo do aparecimento e da progressão das neoplasias orais, vário estudos analisaram a capacidade dos miRNAs contribuírem no diagnóstico destas. Diversos padrões de expressão destas biomoléculas em tecidos com cancro oral e tecidos sãos são constantemente investigados.
Esta revisão analisou igualmente tecnologias imagiológicas de deteção dos miRNAs que foram reportadas nos últimos oito a dez anos. Visto que os miRNAs são candidatos importantes no controlo do cancro oral, um dos focos da investigação foi o desenvolvimento de métodos de deteção destes miRNAs. Diversos métodos e técnicas foram abordados, sendo que cada um destes apresenta as suas vantagens e limitações. No entanto, destacam-se as técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, porque revelam quantidades relativamente pequenas de miRNAs nos tecidos e nos fluídos humanos permitindo uma deteção eficaz destas biomoléculas.
Relativamente ao material humano para biópsia do cancro oral, a saliva é cada vez mais usada como biópsia líquida, uma vez que é uma fonte de biomarcadores (apesar de também apresentar limitações). A dificuldade na quantificação, na escolha do melhor método de deteção dos miRNAs na saliva, etc.) confere aos microRNAs potencialidade como método complementar de diagnóstico do cancro oral mas em simultâneo exige que sejam efetuadas mais investigações de forma a poderem substituir os métodos de diagnóstico convencionais.
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