MITOCONDRIAL E MORFOMETRIA GEOMÉTRICA DE ASAS

Nesse capítulo foram feitas análises interpopulacionais e intrapopulacionais sobre os indivíduos de Eg. cordata e El. nigrita, espécies da tribo muito comuns em áreas do estado de Sergipe, e que são citadas como indicadores ambientais de diversos impactos ambientais. As análises foram baseadas na análise de sequenciamento utilizando os marcadores mitocondriais mtD09 e Barbee e no uso da morfometria geométrica das asas anteriores direitas das abelhas. Por meio da morfometria geométrica, que pode sofrer influência das condições ambientais em que se encontra, foi possível verificar que para a espécie Eg. cordata as populações foram classificadas corretamente com uma porcentagem a cima de 94%, já para El. nigrita os valores foram a cima de 86%. Os marcadores do mtDNA mostraram que existe diferença significante entre as áreas em estudo para as espécies analisadas onde as populações encontram-se estruturadas em cada bioma, mas heterogêneas entre estes. Os resultados obtidos podem ser explicados pelas condições que se encontram as áreas em que os indivíduos foram coletados como também se deve a eventos antigos em consequência das mudanças climáticas ocorridas.

Introdução

Diversos estudos têm mostrado em consenso o declínio das populações e de maneira geral a saúde das abelhas por todo mundo, isso ocorre devido aos vários fatores conhecidos ou desconhecidos e que podem agir isoladamente ou em conjunto (WILLIAMS, TARPY, et al., 2010). Dentre os diversos fatores, a fragmentação do habitat natural tem sido apontada como uma das maiores causas da redução da biodiversidade local e global, e vem atuando de forma intensa em diversas populações (CHACOFF e AIZEN, 2006; KLEIN, STEFFAN-DEWENTER e TSCHARNTKE, 2006; MELO, MARTINS e GONÇALVES, 2006; TYLIANAKIS, KLEIN, et al., 2006; PAULA, 2009).

A perda acelerada das espécies e ecossistemas é um problema visto no mundo inteiro, sendo agravada com a intensificação do desmatamento nos ecossistemas tropicais onde se concentra a maior parte da biodiversidade. No Brasil, esse impacto é sentido em todos os biomas, mas considerado ainda mais grave na Mata Atlântica por estar restrita à pequenos fragmentos, embora possa ser observada em áreas de Cerrado, no Pampa e na Caatinga (GANEM, 2011).

Em vista a avançada degradação do ambiente, a perda da diversidade genética associada ao declínio do tamanho populacional pode ser agravada quando o fluxo gênico é limitado ou interrompido, levando à extinção potencial das populações locais (FRANKHAM, BALLOU e BRISCOE, 2010; PENHA, GAGLIANONE, et al., 2014). O conhecimento da estrutura genética de uma população é essencial para identificar as necessidades e permitir um trabalho de conservação das populações que estão sofrendo impactos antropogênicos (FRANKHAM, BALLOU e BRISCOE, 2010).

Uma das ferramentas utilizadas no estudo de populações é o DNA mitocondrial (mtDNA) que possui características únicas como herança uniparental e alta taxa de mutação (BROWN, GEORGE JR e WILSON, 1979; MORITZ, DOWLING e BROWN, 1987;

FRANCISCO, 2002; OI, 2010) O genoma mitocondrial animal em geral é formado por uma molécula de DNA pequena e circular com uma estrutura simples (WILSON, CANN, et al., 1985).

Desde a década de 1970 a análise do mtDNA tem se estabelecido como uma poderosa ferramenta para estudos evolutivos em animais (MORITZ, DOWLING e BROWN, 1987). Em abelhas, o primeiro estudo do mtDNA no Brasil ocorreu com a espécie Apis mellifera (ARIAS, SOARES e NOBREGA, 1990) sendo uma das principais

moléculas empregadas no entendimento da estrutura populacional, mecanismos de dispersão e determinação da capacidade de disseminação destas abelhas devido à barreiras geográficas (SHEPPARD, RINDERER, et al., 1991a; SHEPPARD, SOARES, et al., 1991b; LOBO, 1995), e foi esta, também, a primeira espécie de Hymenoptera que teve o sequenciamento total do genoma mitocondrial realizado (CROZIER e CROZIER, 1993).

As abelhas Euglossini, conhecidas como abelhas das orquídeas, são importantes polinizadores de diversas espécies vegetais e desenvolveram uma íntima relação com a família Orchidaceae. Podendo ser encontradas em florestas Neotropicais, destacam-se pela sua coloração e uma longa glossa (DRESSLER, 1982; ROUBIK, 1989; BÚRQUEZ, 1997;

NEMÉSIO, 2009; ZIMMERMANN, 2010; SANTOS, MATEUS e NASCIMENTO, 2012).

Apontadas por vários autores como sendo indicadores de impactos sofridos pelo meio ambiente, à exemplo do desmatamento e da fragmentação de habitat, as espécies desta tribo estão sendo utilizadas como foco de estudos genéticos na última década (GIANGARELLI, FREIRIA, et al., 2009). Atualmente, é possível verificar o registro da primeira extinção local de uma espécie do grupo (NEMÉSIO, 2011), apesar disto os estudos da genética dessas abelhas tem apresentado altos níveis de diversidade e certa estruturação genética (ZIMMERMANN, SCHORKOPF, et al., 2011; ROCHA-FILHO, CERÂNTOLA, et al., 2013; BOFF, SORO, et al., 2014; SUNI, BRONSTEIN e BROSI, 2014;

PENHA, GAGLIANONE, et al., 2014).

Poucas são as informações encontradas em relação ao grau de diferenciação desse grupo quanto à morfologia nos diferentes ambientes. A definição da forma de uma estrutura biológica é regida por processos que operam em diferentes escalas e níveis organizacionais de complexidade, assim o aspecto fenotípico resultante de uma estrutura biológica é o resultado das interações entre os caracteres genéticos e as características desenvolvidas devido aos fenômenos ecológicos e as forças evolutivas provocadas por eventos aleatórios, estocásticos, e/ou determinados (Levin , 1992).

Dados morfológicos como o tamanho corporal, extensão, largura e formato das asas são considerados passíveis de variação, sendo úteis na diferenciação de populações (Roubik, 1989). Para avaliar as características de diferentes populações buscando identificar possíveis subespécies algumas técnicas são aplicadas; um exemplo é a análise morfométrica, que é utilizada para avaliar os padrões de variação geográfica e diferenciação intraespecífica em abelhas (Ruttner, 1988), esta ferramenta tem se mostrado muito eficiente para identificar e separar espécies, subespécies e ecotipos

(FRANCOY, WITTMANN, et al., 2008; FRANCOY, SILVA, et al., 2009; FRANCOY e IMPERATRIZ-FONSECA, 2010).

Em abelhas sociais, a caracterização das populações tem sido objeto de estudo dessa ferramenta onde estão sendo obtidas importantes informações sobre a discriminação e identificação das diferenças e semelhanças entre colônias nas diferentes localizações geográficas de sua distribuição (FILHO e MALASPINA, 1995; DINIZ-FILHO, BALESTRA, et al., 1998; WALDSCHMIDT, 1999; BAYLAC, VILLEMANT e SIMBOLOTTI, 2003; ARAÚJO, COSTA, et al., 2004; FRANCOY, PRADO, et al., 2006)

Entre os métodos utilizados nessa ferramenta, os marcos anatômicos merecem destaque por representar as formas através de dados numéricos, que podem ser obtidos por coordenadas médias de marcos distribuídos perifericamente, ou ainda por meio da distância entre os marcos escolhidos (DI MARE e CORSEUIL, 2004). O teste é baseado nas variações das coordenadas Cartesianas desses marcos anatômicos permitindo analisar e identificar, nas estruturas morfológicas dos exemplares, variações de forma (ROHLF e MARCUS, 1993).

Para tal, uma estrutura muito utilizada nas análises morfométricas são as asas dos insetos, isso ocorre por estas serem planas, o que possibilita a obtenção de muitas informações (NUNES, COSTA-PINTO, et al., 2007), e também devido à presença de diversos marcos anatômicos, principalmente na inserção das nervuras (GRODNITSKY, 1999). Os primeiros estudos utilizando essa ferramenta e os padrões de venação das asas anteriores foram realizados em abelhas africanizadas e algumas de suas subespécies conseguindo 85% de classificações corretas entre as subespécies de Apis mellifera Linnaeus (FRANCOY, GONÇALVES e WITTMANN, 2006; FRANCOY, WITTMANN, et al., 2008); em abelhas do gênero Plebeia Schwarz (SILVA, 2006), com populações das espécies Nannotrigona testaceicornis Lepeletier (MENDES, FRANCOY, et al., 2007) e Melipona quadrifasciata Lepeletier (NUNES, ARAÚJO, et al., 2008) também apresentaram resultados eficientes utilizando esta técnica.

O uso dessa técnica exige do pesquisador um menor investimento laboratorial, baixo custo de análises, pois existem vários programas gratuitos para análises das espécies e estudos de variação populacional, biogeografia, evolução assimetria, além dos dados resultantes destas análises poderem ser associados aos dados moleculares (ARAÚJO, 2010). Os resultados até então encontrados demonstram uma eficácia desta

ferramenta, por ser rápida e de baixo custo, sendo assim, útil e adequada para identificação das espécies e análise da variabilidade dentro dos grupos em estudo.

Devido ao exposto e visto que muitos trabalhos realizados com espécies da tribo Euglossini indiquem uma alta variabilidade genética nas populações do Brasil, buscou-se aqui verificar como as populações de Eg. cordata e El. nigrita encontram-se estruturadas nas áreas de estudo.

Objetivos

O objetivo deste capítulo foi por meio do uso de marcadores de DNA mitocondrial e da técnica de morfometria genética, discriminar populações de duas espécies de Euglossini (El. nigrita e Eg. cordata) provenientes de três biomas diferentes no Brasil, buscando avaliar a diversidade do DNA mitocondrial e dos padrões morfométricos e verificar a existência de possíveis ecotipos entre estes, mais especificamente:

• Estimar a variabilidade genética das populações amostradas;

• Verificar se as populações estão estruturadas geneticamente;

• Avaliar se as populações dessas espécies presentes em áreas de Caatinga, Mata Atlântica e Cerrado encontram-se morfologicamente distintas;

• Caracterizar por meio da morfometria geométrica as asas anteriores (direita) de El. nigrita e Eg. cordata;

• Comparar os dendrogramas de proximidade morfológica das espécies em estudos a partir das distâncias produzidas pelas análises de morfometria geométrica.

Materiais e Métodos

Coleta do material. As espécies Euglossa cordata Linnaeus e Eulaema nigrita Lepeletier foram escolhidas para as análises de mtDNA por estarem presentes de forma abundante nas áreas de estudo; foram empregados apenas machos dessas espécies uma vez que apenas estes são atraídos pelas iscas odoríferas (ver detalhes Cap. 2).

Os indivíduos foram atraídos com o uso de compostos aromáticos e capturados com auxílio de rede entomológica, acondicionados individualmente, em frascos de vidro e sacrificados por resfriamento. No laboratório, estes tiveram o primeiro par de pernas

removido e conservado em álcool etílico absoluto (P.A.-A.C.S – Synth; 99,5%) até as análises, que foram realizadas no Laboratório de Biologia e Genética em Abelhas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP.

Foram coletados 60 indivíduos, de cada das espécies em cada um dos biomas:

Caatinga (municípios de Poço Redondo e Canindé do São Francisco), Mata Atlântica (município de Capela) e Cerrado (município de Pedregulho), sendo os dois primeiros áreas de proteção ambiental localizados no estado de Sergipe e o último em São Paulo (Figura 1). A Reserva de Vida Silvestre Mata do Junco é recoberta pelo bioma Mata Atlântica caracterizado pela alta diversidade de espécies e alto grau de endemismo, devido à sua grande extensão e diferentes composições vegetais podem ser encontrados em vários tipos de relevos, paisagens e características climáticas diversas (LAGOS e MULLER, 2007).

O Monumento Natural Grota do Angico é composto pela Caatinga, bioma exclusivamente brasileiro caracterizado pela presença de floresta arbórea ou arbustiva composta por árvores xerofíticas com regime de chuvas de deficiência hídrica na maior parte do ano e alta taxa de evapotranspiração o que influencia na disponibilidade e qualidade da vegetação (Moreira, et al., 2006). A Estância Alto da Boa Vista compreende uma área de Cerrado do estado de São Paulo, apresenta clima estacional com chuvas entre os meses de outubro e março e temperaturas amenas (KLINK e MACHADO, 2005).

As distâncias par-a-par das áreas de coletas podem ser vistas na Tabela 1.

Figura 1 Localização geográfica mostrando a distância entre os pontos de coletas dos indivíduos utilizados nas análises.

Ca – Caatinga Ce – Cerrado Ma – Mata Atlântica

Ce

Ma

Tabela 1 Distância em linha reta entre as áreas de coleta

Ponto de coleta Caatinga Cerrado Mata Atlântica Caatinga

Cerrado 1568,29

Mata Atlântica 120,64 1542,54

* Distância em quilômetros

Extração do DNA mitocondrial. O método de Chelex (adaptado de Walsh et al. 1991) foi seguido para a obtenção do DNA das Euglossini. Assim o primeiro par de pernas da abelha foi removido, conservado em álcool etílico absoluto (P.A.-A.C.S – Synth; 99,5%) e congelado até o período de análises, quando então as pernas foram maceradas levemente em 100μl da solução de Chelex 5% e adicionado de 5µl da proteínase K. A solução obtida foi incubada em termociclador por 60min à 55°C seguido por 15min à 99°C e finalizando por 1min a 37°C, sendo mantido refrigerado à 4°C até o congelamento. O DNA, pronto para análise foi mantido congelado à -20°C (SOFIA, PAULA, et al., 2005; PASCUAL, 2006).

Reação de Polimerase em Cadeia – PCR. A reação de PCR foi realizada em aparelho termociclador e compreendeu de 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão, seguindo o protocolo utilizado por Bonatti (2012).

A reação de PCR foi realizada com 2µL do sobrenadante da extração com Chelex como DNA molde, 10µL de Promega Master Mix 2x, 1µL de cada primer totalizando um volume de 20µL com água Milli – Q autoclavada. A amplificação do lócus de COI foi feita em um termociclador Applied Biosystems, geneAmp®, PCR System 9700. Foram realizados testes iniciais para encontrar as condições ideais para as PCRs de modo a evitar saturação.

Após a amplificação, foi verificada a existência do fragmento esperado a partir de 2µL da reação de PCR submetidos a eletroforese em Gel de Agarose 1% contendo brometo de etídio (0,01 μL/mL de gel de agarose) em tampão 1x TBE (0,45M Tris Base;

0,45M Ácido Bórico; 0,5M EDTA, pH 8,0). Posteriormente, cada gel foi visualizado digitalmente com o uso de um foto-documentador KODAK EDAS 290. Um marcador de

peso molecular com intervalo de 100 pares de base (Invitrogen nº Cat 15628-050) foi utilizado em uma das pistas de cada gel.

Purificação. O DNA amplificado restante da reação de polimerase em cadeia foi purificado de acordo com o protocolo do fabricante Promega (Wizard^® SV Gel and PCR Clean-up System) e submetidos ao sequenciamento no Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica – CREBIO (FCAV – UNESP – Campus Jaboticabal).

Amplificação do gene mitocondrial. Seguindo a metodologia de Bonatti (2012) no estudo de Melipona subnitida Ducke, foi feita a amplificação e análise do gene mitocondrial, de acordo com a metodologia que será descrita a seguir.

O material genético foi submetido à PCR para amplificação do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI), para tal foram usados primers considerados universais mtD9 (5’ – CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC – 3’) e barbee (5’ – CAACAAATCATAAAAATATTGG – 3’) (Simon, Frati et al, 1994) que são assim classificados por amplificarem fragmentos em uma ampla variedade de organismos,de acordo com o programa a baixo (Figura 2):

Figura 2: Ciclos de reação para gene mitocondrial amplificação dos COI

Preparo do material para aquisição dos dados morfométricos. As abelhas tiveram sua asa anterior retirada do corpo dos exemplares com auxílio de pinça, seguindo estas foram umedecidas em uma mistura de álcool 70% e água e

posteriormente com auxílio de um pincel foram montadas com lâmina e lamínula de microscopia, previamente estas asas foram identificadas com um código referente ao indivíduo do qual foi retirada (Figura 3).

Após a montagem, com a utilização de microscópio estereoscópio com câmera fotográfica acoplada as lâminas contendo as asas foram fotografadas e armazenadas digitalmente. Seguindo, as análises foram realizadas com auxílio de programas computacionais disponíveis gratuitamente na internet através do domínio:

http://life.bio.sunysb.edu/morph/.

Figura 3 Lâminas semi-permanentes montadas com as asas retiradasdos machos de El.

nigrita (A) e Eg. cordata (B).

Para avaliar o padrão de venação das asas anteriores e suas deformações parciais foi criado um arquivo com extensão .tps com auxílio do programa tpsUtil versão 1.40 (ROHLF, 2008a), que tem como função servir de banco de dados para o armazenamento de coordenadas Cartesianas dos marcos anatômicos assinalados nas imagens previamente armazenadas. As coordenadas cartesianas dos marcos anatômicos de cada conjunto amostral foram marcadas manualmente (Figura 4) nas junções de nervuras das células das asas com auxílio do software tpsDig 2.12 (ROHLF, 2008b); a ordem de

introdução dos marcos anatômicos foi a mesma pra cada indivíduo, este é um requisito para o estabelecimento da homologia das estruturas de acordo com as coordenadas obtidas, cada marco anatômico refere-se a uma coordenada (Silveira, 2011).

Figura 4 Vista da asa direita anterior de Euglossa cordata (A) e Eulaema nigrita (B) com a posição dos 15 marcos anatômicos, os pontos em vermelho representam o posicionamento dos marcos nas junções das nervuras.

Para gerar as mudanças de forma a partir dos marcos anatômicos, as configurações individuais foram alinhadas pelo Método de Superposição dos Quadrados Mínimos de Procrustes no programa e tpsRelw 1.42 (ROHLF, 2005).

O método de Procrustes (Bookstein, 1996), consiste de três etapas, onde o tamanho das imagens das asas é uniformizado, por sobreposição destas com base em seus centroides e tiveram a interferência da orientação corrigidas para serem alinhadas de maneira correta e com o somatório das distâncias entre os marcos homólogos sendo

a menor possível (Figura 5) esse procedimento é realizado para reduzir a influência ambiental sobre o desenvolvimento dos indivíduos.

Figura 5 Representação gráfica da padronização de tamanho das asas e alinhamento dos marcos anatômicos para realização da análise de morfometria geométrica. Fonte:

(Grassi, 2009).

Análises estatísticas.

DNA mitocondrial

A partir dos resultados obtidos com os marcadores as sequências foram editadas pelo software ChromasPro versão 1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Qld, Australia) e alinhadas pelo BioEdit, Biological sequence alignment editor, versão 7.2.5 (HALL, 1999);

Após serem organizadas as sequências foram analisadas pelos com o uso do software DNAsp v.5.10 (LIBRADO e ROSAS, 2009) para separar os haplótipos em seus respectivos grupos e determinar o número de sítios polimórficos (S), número de haplótipos (h), diversidade haplotípica (Hd), diversidade nucleotídica (π) e o número médio de diferenças nucleotídicas (k) (FRANCISCO, 2002).

Já o programa Arlequin 3.5 (EXCOFFIER e LISCHER, 2010) foi empregado para estimar o grau de diferenciação intrapopulacional (Fst), baseado nas frequências haplotípicas, realizando o teste exato juntamente com o método da cadeira de Markov;

nesse mesmo software foi realizado o estudo da estrutura populacional empregando-se a análise de variância molecular (AMOVA) (EXCOFFIER, SMOUSE e QUATTRO, 1992) , essa análise serviu para gerar estimativas da variância genética em diferentes níveis hierárquicos e o valor de estatística ϕST que é definido como a correlação entre haplótipos retirados ao acaso de uma população, em relação ao total de haplótipos da espécie (EXCOFFIER, SMOUSE e QUATTRO, 1992); como também calculou o índice Fst entre pares de população que pode ser usado como distância genética entre elas.

A rede de haplótipos foi construída usando o software NETWORK v. 4.6. (POLZIN, 2013), empregando o algoritmo Median Joining que identifica os haplótipos mais proximamente relacionados. Também foi construído um dendograma baseado nas distâncias genéticas pelo método de Neighbor Joing com auxílio do programa MEGA v. 6 (TAMURA, STECHER, et al., 2013).

Morfometria geométrica

Com o uso do programa MorphoJ 1.03a (Klingenberg, 2008) a sobreposição de Procrustes, produção da matriz de covariância, análise de componente principal e de variável canônica para identificação dos grupos, análise discriminante para verificação da variabilidade dos grupos seguido de testes de validação foram realizadas, além disso foi feito o cálculo das distâncias de Mahalanobis. A construção do dendrograma de proximidade morfológica, método Neighbor Joining (SAITOU e NEI, 1987), foi realizada pelo programa MEGA versão 6.0 (TAMURA, STECHER, et al., 2013).

A Análise de Componentes Principais não requer um agrupamento a priori por ser uma técnica exploratória, que possibilita verificar inicialmente a presença de grupos distintos em um conjunto de dados; já a Análise de Variável Canônica, assemelha-se à de Componentes Principais, exceto pela delimitação dos dados por grupo, o que permite identifica a variação entre e dentro dos grupos e assim formar agrupamentos (CAVALCANTE e LOPES, 1998).

A distância geográfica, em linha reta entre as populações estudadas, foi dada em quilômetros a partir das coordenadas geográficas marcadas com uso de GPS e utilizando

a ferramenta Google Maps. Para verificar correlações entre estas distâncias e as distâncias morfológicas foi também utilizado o teste de Mantel com auxílio do software TFPGA.

Resultados

DNA mitocondrial

A amplificação por PCR da região Citocromo Oxidase subunidade I, assim como o processo de purificação dos fragmentos amplificados foram bem sucedidos em ambas espécies (Figura 6).

Figura 6 Gel de agarose 1% corado com brometo de etila e visualizado em luz UV mostrando os fragmentos de COI. A seta indica a direção de migração no gel.

Eg. cordata

Do total de reações de sequenciamento realizadas para a região do gene COI compreendida entre os primers BarbeeF/Mtd9 (SIMON, FRATI, et al., 1994; FRANCOSO e ARIAS, 2013) para Euglossa cordata foram analisadas 59 sequências de indivíduos provenientes da Caatinga da e Mata Atlântica; no Cerrado durante o período de coletas foram obtidos apenas 10 indivíduos, sendo que as sequências destes foram excluídas das

análises aqui apresentadas devido à problemas durante o sequenciamento e também pela contaminação de algumas amostras.

As reações de PCR realizadas produziram fragmentos com 612pb, estando dentro do esperado (aproximadamente 600pb), nestes foram detectados 33 haplótipos correspondentes a 35 sítios variáveis (Tabela 2).

Tabela 2 Haplótipos encontrados nas sequências analisadas da região COI de Euglossa

12,09%. O fragmento consenso isolado foi alinhado à sequência do genoma mitocondrial de COI desta mesma espécie (número de acesso NCBI GeneBank: AY920307.1)

(RAMÍREZ, ROUBIK, et al., 2010), correspondendo à posição nucleotídica 2 a 489 pb (Figura 7).

Tabela 3 Frequência da distribuição dos haplótipos nas populações de Euglossa cordata amostradas.

Haplótipo Caatinga (19) Mata Atlântica (39)

H1 0 1

Figura 7 Alinhamento entre sequências nucleotídicas de Euglossa cordata obtidas por meio do sequenciamento (Query) e do banco de dados NCBI (Sbjct), onde foi obtido 97% de alinhamento.

Ao contrário do indicado para a Mata Atlântica a diversidade nucleotídicas foi alta dentro da população da Caatinga. O número de sequências usadas, de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), bem como a diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) e o número médio de diferenças haplotípicas (K) para cada população foram resumidos na

Ao contrário do indicado para a Mata Atlântica a diversidade nucleotídicas foi alta dentro da população da Caatinga. O número de sequências usadas, de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), bem como a diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (Hd) e o número médio de diferenças haplotípicas (K) para cada população foram resumidos na