A modelagem molecular permite explorar aspectos tridimensionais de reconhecimento molecular e vem sendo utilizada com êxito em estratégias de modelagem direta e indireta de novos fármacos. O desenho e a visualização de estruturas 3D, com fatores estéricos relevantes para a atividade biológica, são importantes para análise de tamanho, volume e formato das moléculas. Novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela análise de dados teóricos de estrutura-atividade de forma tridimensional, obtidos por técnicas recentes de modelagem molecular, constituindo-se em uma ferramenta útil no planejamento de novos fármacos (SANT'ANNA, 2009; JORDAN e ROUGHLEY, 2009).
Os métodos de cálculo a serem aplicados à molécula são determinados pela estratégia de modelagem molecular. Estes métodos podem ser clássicos, como os utilizados em mecânica molecular para definições de conformações mais estáveis, ou, no outro extremo, quânticos, como os métodos ab initio, que calculam energia e densidade eletrônica nos orbitais. A aplicação de um ou outro método é determinada pelo compromisso entre tempo e precisão dos resultados e pela complexidade do sistema a ser analisado (LEACH, 2001; RODRIGUES, 2001).
Nos métodos de mecânica molecular, a análise conformacional de uma molécula pode ser realizada pela rotação de uma ligação simples, com mudança simultânea dos ângulos de torção ou diedro das ligações, e cálculos correspondentes de energia estérica, decorrente da sobreposição espacial de átomos não-ligados e barreiras torsionais de rotação. Esta análise consiste na exploração das formas espaciais energeticamente favoráveis de uma molécula,
38 chamadas de conformações. Durante a geração de uma determinada estrutura, ocorrem distorções na geometria na molécula, incluindo comprimentos de ligação, ângulos de ligações e ângulos diedros. Átomos não-ligados, também, interagem em uma mesma região do espaço e provocam repulsão estérica e eletrostática. Para corrigir estas distorções, as moléculas são otimizadas pelo processo de minimização de energia, quer seja por mecânica molecular ou mecânica quântica. A minimização de energia e a análise conformacional são usadas, interativamente, para otimizar a geometria de uma molécula (CRAMER, 2004; CARVALHO et al., 2003; HÖLTJE et al., 2003).
Na mecânica molecular, a energia de cada geometria é calculada e comparada entre ângulos e distâncias de ligação entre átomos que compõem a molécula, com valores tabelados. A molécula é descrita como um conjunto de “átomos conectados”, ao invés de núcleos e elétrons, como acontece nos métodos quânticos. Estes átomos são considerados como esferas de diferentes tamanhos, conectados por molas (ligações) de comprimento variável, onde os elétrons não são considerados explicitamente e a energia potencial da molécula é uma função de variáveis geométricas, ou seja, as equações obtidas por mecânica molecular consideram apenas os átomos e não incluem os elétrons nos cálculos. Como resultado desta simplificação, a mecânica molecular é um método computacional relativamente rápido e aplicável às estruturas moleculares pequenas (CRAMER, 2004; HÖLTJE et al., 2003; SANT'ANNA, 2009).
O programa determina as interações moleculares resultantes do estiramento das ligações, deformação angular, torsional e espacial e calcula a energia da molécula de partida de forma comparativa e relacionada com moléculas padrão. Uma coleção destes valores de referência e das constantes de força é conhecida como campo de força. Muitos campos de força estão disponíveis, diferindo, principalmente, quanto ao tipo de sistema mais adequado para serem usados e o número e tipo de funções de energia que compõe o campo (HÖLTJE et
al., 2003; SANT'ANNA, 2009).
O processo de mecânica molecular promove a modificação dos ângulos e comprimentos das ligações dos átomos e fornece novas conformações com os correspondentes cálculos de energia. O objetivo da mecânica molecular é predizer a energia associada com determinada conformação de uma molécula. Porém, a energia estérica, obtida por mecânica molecular, não expressa quantidades absolutas, apenas diferenças de energia entre duas ou mais conformações (CARVALHO et al., 2003; HÖLTJE et al., 2003).
Diferente do processo de mecânica molecular, a mecânica quântica usa as equações de física quântica para calcular as propriedades de uma molécula, a partir das interações entre elétrons e núcleos. O movimento dos elétrons é considerado mais rápido e independente do núcleo e, uma vez que os elétrons giram em torno do núcleo, é possível descrever a energia eletrônica separadamente da energia nuclear. Os cálculos de mecânica quântica não são exatos, pois são feitas algumas aproximações, podendo ser subdivididos em métodos ab initio e semi-empírico (CARVALHO et al., 2003).
O método ab initio, por considerar todos os elétrons do sistema, pode ser aplicado apenas a moléculas pequenas e, apesar de não necessitar de dados empíricos, requer grande capacidade de memória e tempo de cálculo do computador. O método semi-empírico, por considerar apenas os elétrons da camada de valência, é menos exato, porém mais rápido e pode ser utilizado na minimização de energia de moléculas que variam de 10 a 120 átomos. A energia é calculada utilizando a equação de Schrödinger, a partir de parâmetros armazenados. O programa MOPAC é um pacote de métodos semi-empíricos (MINDO/3, MNDO, MNDO- d, AM1, PM3, RM1), que são usados para cálculos termodinâmicos, reações químicas, cálculo de mapa de potencial eletrostático e outros (SANT'ANNA, 2002; CRAMER, 2004).
A visualização das propriedades moleculares, após simulação das características eletrônicas geradas pelos cálculos mecânico-quânticos, pode ser feita por técnicas gráficas, que são usadas para apresentar uma variedade de resultados computacionais como o mapa de potencial eletrostático molecular (MEP), mapas de densidade HOMO (“Highest Occupied Molecular Orbital” ou orbital molecular de mais alta energia ocupado) e LUMO (“Lowest Unoccupied Molecular Orbital” ou orbital molecular de mais baixa energia desocupado) (SHRIVER et al., 2008).
A modelagem molecular tem sido usada, também, para entender o mecanismo e a seletividade de reações enzimáticas. Os dados obtidos podem ser usados para orientar modificações da estrutura do substrato ou da enzima, no intuito de melhorar a seletividade da reação (DE OLIVEIRA et al., 2009). Pereira et al. (1998) estudaram as estruturas tridimensionais das enzimas álcool desidrogenase e lactato desidrogenase, utilizando técnicas de modelagem molecular (docking), modelando a interação dessas enzimas com três ésteres de acetoacetato (de etila, de octila, e de dodecila). Foi observado que alguns ésteres ligavam- se, irreversivelmente, a uma das duas enzimas, inibindo-a. Também foi possível verificar que, mais provavelmente, a ligação dos ésteres com a enzima álcool desidrogenase se dava pela
40 face si enquanto que com a enzima lactato desidrogenase se dava pela face re, o que poderia explicar os resultados experimentais de reações de redução. Com isso, concluíram que a configuração resultante no produto é dependente da enzima que atua na reação, bem como da molécula do éster utilizado como substrato. Propuseram que, estando ambas as enzimas presentes no microrganismo, novos substratos poderiam ser projetados para inibir uma das enzimas, aumentando a disponibilidade das outras de interesse. Mais recentemente, De Oliveira et al. (2009) estudaram por modelagem molecular a regiosseletividade da lipase B de
Candida Antarctica sobre flavonoides. Santaniello et al. (2009) também utilizaram a
modelagem molecular como ferramenta para analisar a enantiosseletividade em fase orgânica da reação de transesterificação de álcoois aromáticos primários com ésteres vinílicos com cadeias de diferentes comprimentos, utilizando lipase de Burkholderia cepacia.
Os trabalhos mencionados anteriormente somente foram possíveis com a obtenção, em bancos de dados, de informações cristalográficas das enzimas estudadas. No entanto, nem sempre os dados cristalográficos das enzimas atuantes num processo de biocatálise estão disponíveis. Em alguns casos, nem ao menos é conhecida com certeza a enzima atuante, o que dificulta a abordagem pela metodologia utilizada por estes pesquisadores. Além disso, as biocatálises que utilizam microrganismos íntegros envolvem a ação de muitas enzimas, não sendo totalmente aplicável o estudo somente com enzimas isoladas. Dentre os citados, o trabalho de Pereira et al. (1998) é o que mais se aproxima da utilização de células íntegras, pois mostra como a competição de duas enzimas pelo substrato pode gerar diferentes isômeros. O presente projeto propõe uma abordagem diferente na utilização da modelagem molecular para o estudo de biocatálises, fazendo um paralelo com a metodologia utilizada para a previsão de atividade de drogas.
4 METODOLOGIA
4.1 SUBSTRATOS DE REDUÇÃO
As reações de redução foram realizadas com os seguintes β-cetoésteres:
3-oxobutanoato de etila (1) (Aldrich), 99%, densidade (d) = 1,030 g/mL 3-oxopentanoato de metila (3) (Aldrich), 98%, d = 1,037 g/mL
3-oxopentanoato de etila (4) (Aldrich), 97%, d = 1,012 g/mL 3-oxohexanoato de etila (5)(Aldrich), 98%, d = 0,989 g/mL
4-cloro-3-oxobutanoato de metila (7) (Aldrich), 97%, d = 1,305 g/mL 4,4,4-tricloro-3-oxobutanoato de etila (8) (Aldrich), 95%, d = 1,389 g/mL 4,4,4-triflúor-3-oxobutanoato de etila (9) (Aldrich), 99%, d = 1,259 g/mL 3-(4-clorofenil)-3-oxopropanoato de metila (11) (Aldrich), 95%, d = 1,255 g/mL
4.2 REDUÇÃO MICROBIANA
MICRORGANISMO, MEIO DE CULTIVO E CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO
O microrganismo selecionado é o fungo leveduriforme Kluyveromyces marxianus, gentilmente cedido da Coleção do Departamento de Engenharia Bioquímica (Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro). A cultura foi mantida em Agar Sabouraud Dextrose e armazenada a 4ºC.
42 glicose, 10; extrato de levedura, 5; sulfato de amônio, 1; sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1; peptona de carne, 5. Ajustou-se o pH inicial do meio para 5,5 e este foi esterilizado em autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Para a obtenção da biomassa utilizada nos experimentos de biorredução, a levedura
Kluyveromyces marxianus foi previamente cultivada em tubo de ensaio contendo Agar
Sabouraud Dextrose por 5 dias em temperatura ambiente. A cultura de cada tubo foi suspensa cuidadosamente com alça de níquel-cromo e 2 mL de água estéril e transferida para um tubo estéril. Transferiu-se 1 mL desta suspensão aquosa de células para cada frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidade, contendo 50 mL de meio de cultivo líquido para obtenção da biomassa. Após a inoculação, o meio foi mantido sob agitação de 150 rpm em agitador/incubador (Reciprocal Water Bath Shaker – Series 25D – New Brunswick Scientific), a 30ºC, durante 48h. A biomassa formada foi separada por centrifugação (3500 rpm por 10 minutos) e lavada duas vezes com água destilada para utilização nos experimentos de biorredução na concentração de 4-5g/L (peso-seco).
BIORREDUÇÃO
A biomassa obtida na concentração de 4-5g/L foi adicionada a 50mL de meio de redução com a seguinte composição (g/L): glicose, 50; cloreto de magnésio, 1 (RAMOS, 2009). O substrato (0,25% v/v), solubilizado em 0,5mL de etanol, foi adicionado após 30 minutos. Os experimentos foram realizados a 30C e 150 rpm, em triplicata ou quadruplicata. Após 24h de incubação, a biomassa foi separada por centrifugação e o produto presente no sobrenadante foi extraído com diclorometano ou acetato de etila. A fase orgânica foi seca com salmoura e sulfato de sódio anidro ou sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente, evaporado. As amostras foram analisadas para determinação da conversão e do excesso enantiomérico.
REDUÇÃO QUÍMICA (Síntese do racemato)
Com o propósito de sintetizar padrões para a caracterização dos produtos de reação microbiológica, visto que não há no mercado padrões de beta-hidróxiésteres para todos os beta-cetoésteres selecionados, utilizou-se diferentes metodologias de redução química aquiral com boroidreto de sódio, em dois diferentes meios reacionais, metanol e glicerol.
No procedimento reacional clássico, a redução química dos oito beta-cetoésteres foi conduzida com boroidreto de sódio utilizando-se metanol como solvente, sob temperatura de 0°C, em banho de gelo e agitação magnética constante. A formação do produto foi acompanhada por cromatografia em camada fina. Constatando-se o total consumo do substrato, o meio foi acidificado com solução de ácido clorídrico (10% v/v) para interrupção da reação. Após o isolamento, o produto foi levado a uma bomba de alto vácuo para evaporação do solvente e posterior cálculo do rendimento bruto por pesagem.
Visando a otimização da redução química para obtenção dos padrões racêmicos, os oito beta-cetoésteres foram submetidos, também, a um procedimento não convencional, sendo utilizado glicerol como solvente nas reações com boroidreto de sódio, sob temperatura ambiente e agitação magnética constante. A formação do produto foi acompanhada por cromatografia em camada fina. Constatando-se o total consumo do substrato, o meio foi acidificado com solução de ácido clorídrico (10% v/v) para interrupção da reação. Após o isolamento, o produto foi levado a uma bomba de alto vácuo para evaporação do solvente e posterior cálculo do rendimento bruto por pesagem.
4.3 METODOLOGIA COMPUTACIONAL
As estruturas moleculares dos oito -cetoésteres deste trabalho e dos três - cetoésteres, 3-oxobutanoato de metila (2), 4-cloro-3-oxobutanoato de etila (6) e 3-fenil-3- oxopropanoato de etila (10), publicados no trabalho de Ramos (2009) foram desenhadas e minimizadas no programa Spartan’10® (Wavefunction Inc., em sistema operacional Windows). Todas as estruturas foram calculadas, simulando no vácuo, na forma neutra e sem qualquer restrição geométrica. A análise conformacional para a seleção do confôrmero de mais baixa energia foi realizada pelo método de mecânica molecular, utilizando o compo de forças MMFF (Merck Molecular Force Field), que possui parâmetros adequados e resultados próximos ao experimental para essa atividade (HEHRE, 2001). Em seguida, as estruturas foram submetidas a otimização de geometria, usando o método semi-empírico RM1. O confôrmero com menor energia foi submetido ao cálculo de ponto único (“single point calculation”) pelo modelo DFT-B3LYP, baseado na mecânica quântica, com base 6-31G*. Em seguida, foram obtidos os valores de momento de dipolo molecular, mapa de potencial eletrostático molecular (MEP), mapa de densidade eletrônica HOMO, mapa de densidade eletrônica LUMO, distribuição dos orbitais HOMO e LUMO e lipofilicidade.
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4.4 MÉTODOS ANALÍTICOS
A formação dos produtos nas reduções químicas foi acompanhada por cromatografia em camada fina utilizando placas de sílica gel e a mistura hexano e acetato de etila (7:3 v/v) como eluente. As substâncias nas placas foram visualizadas sob lâmpada de ultravioleta (254- 365nm) e exposição ao vapor de iodo.
A remoção parcial dos solventes foi realizada sob pressão reduzida em evaporador rotatório (Fisatom, modelo 801/802). Em todos os casos, a remoção completa dos solventes foi feita em sistema de auto-vácuo, com pressão variável.
Os substratos e produtos foram caracterizados por espectrometria de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) e infravermelho, polarimetria e cromatografia gasosa de alta resolução.
Na caracterização estrutural dos compostos foram utilizados: aparelho Moran Ultra (Oxford Instruments) de 300MHz para RMN (Laremn-IQ-UFF), utilizando-se clorofórmio deuterado (CDCl3) como solvente; espectrômetro Perkin-Elmer 1420, empregando-se pastilhas de KBr, para espectrofotometria de infravermelho (IV).
A configuração absoluta dos produtos biorreduzidos foi elucidada com a análise em aparelho polarímetro digital automático (PDA 9300 Acatec), linha do sódio D (589nm), operando a 27°C, medido a partir de soluções com CHCl3 em correlação com os dados da literatura.
A conversão e a composição enantiomérica das amostras foram determinadas por cromatografia gasosa de alta resolução, em colunas com fase estacionária quirais (CGAR- QUIRAL) realizadas no LPCC-LADETEC/IQ-UFRJ. Todas as análises foram feitas em cromatógrafo a gás Hewlett Packard modelo HP-5890 (Chemstation), com detecção por ionização de chama utilizando 1,0 µL de volume de amostra. O software utilizado para integração e registro do cromatograma foi o Agillent Chemstation Plus (versão A.08 de 2001). Produtos de redução dos substratos 3-oxopentanoato de metila e 3-oxopentanoato de etila, foram separados com o emprego da coluna capilar BGB-176B (25 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura da coluna, inicialmente a 40°C, foi elevada a uma taxa de 5°C/min até 150°C, tCH4 = 51cm/s, taxa de divisão de fluxo 1:20, fluxo coluna 1,35mL/min., Tinj = 250°C,
Tdet = 250°C (DIC). Para as amostras de redução do 3-oxobutanoato de etila, foi empregada a mesma coluna, com isoterma de 90°C, Tinj = 250°C, Tdet = 250°C (DIC). Para 4,4,4-triflúor-3- oxobutanoato de etila e produtos de redução, foi utilizada a coluna BGB-176 (25 m x 0,25 mm x 0,25 µm) com isoterma de 120°C (5min), tCH4 = 50,1cm/s, taxa de divisão de fluxo 1:100, fluxo coluna 1,06mL/min., Tinj = 250°C, Tdet = 250°C (DIC) . Para os substratos 3- oxohexanoato de etila, 3-(4-clorofenil)-3-oxopropanoato de metila e seus respectivos produtos, foi utilizada a mesma coluna HP-CHIRAL 10B (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). Para o substrato 3-oxohexanoato de etila e seus produtos foi aplicada a isoterma de 90°C. Para o substrato 3-(4-clorofenil)-3-oxopropanoato de metila e seus respectivos produtos, a temperatura da coluna foi mantida, inicialmente, durante 10min a 150°C, foi elevada a uma taxa de 1,5°C/min até 190°C, tCH4 = 61,7cm/s, taxa de divisão de fluxo 1:20, fluxo coluna 2,39mL/min., Tinj = 250°C, Tdet = 270°C (DIC). Produtos de redução do substrato 4-cloro-3- oxobutanoato de metila foram separados com o emprego da coluna Lipodex E (25 m x 0,25 mm). A temperatura da coluna, inicialmente à 70°C, foi elevada a uma taxa de 5°C/min até 130°C (5 min), tCH4 = 51,1cm/s, taxa de divisão de fluxo 1:100, fluxo coluna 2,57mL/min., Tinj = 250°C, Tdet = 270°C (DIC). Para o substrato 4,4,4-tricloro-3-oxobutanoato de etila também foi utilizada a coluna Lipodex E (25 m x 0,25 mm). A temperatura da coluna, inicialmente à 70°C, foi elevada a uma taxa de 5°C/min até 170°C (2 min), tCH4 = 50,5cm/s, fluxo coluna 2,58mL/min., split 1:20; Tinj = 250°C, Tdet = 250°C (DIC).
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na primeira etapa do trabalho, obteve-se β-hidroxiésteres quirais a partir da biorredução enantiosseletiva dos -cetoésteres 3-oxobutanoato de etila (1), 3-oxopentanoato de metila (3), 3-oxopentanoato de etila (4), 3-oxohexanoato de etila (5), 4-cloro-3- oxobutanoato de metila (7), 4,4,4-tricloro-3-oxobutanoato de etila (8),4,4,4-triflúor-3- oxobutanoato de etila (9) e 3-(4-clorofenil)-3-oxopropanoato de metila (11), utilizando a levedura Kluyveromyces marxianus como biocatalisador.
Devido a pouca disponibilidade comercial de padrões dos respectivos beta- hidroxiésteres, foram realizadas sínteses de redução química dos beta-cetoésteres para utilização dos racematos de beta-hidróxiésteres como padrões de redução. Dentre uma variedade de procedimentos sintéticos que podem ser utilizados em laboratórios e indústrias para redução do grupamento carbonila, frequentemente, utilizam-se hidretos metálicos, especialmente boroidretos, devido ao baixo custo e simples utilização. Embora a adição de água seja, muitas vezes, essencial para dissolver o hidreto metálico, o uso da água como meio reacional é limitado porque muitos compostos orgânicos têm baixa solubilidade em água. Assim, geralmente, é utilizado um solvente orgânico de média polaridade (metanol ou etanol) como meio de redução (DAHL e MADSEN, 1998; RODRÍGUEZ et al., 2000; NAKAMURA
et al., 2001; RIBEIRO et al., 2003; RAMOS et al., 2009).
Por outro lado, o glicerol, semelhante a outros solventes orgânicos polares como dimetilsulfóxido e dimetilformamida, facilita a dissolução de sais inorgânicos e complexos de metais de transição, sendo, também, capaz de dissolver compostos orgânicos que são pouco miscíveis em água. O glicerol pode ser empregado como um solvente versátil em diversas reações orgânicas, podendo ser utilizado em metodologias consideradas como química verde por ser um líquido não tóxico, biodegradável, altamente inerte e estável. Além do que, devido
O O OH
ao fato de ser o principal subproduto da conversão de óleo e gordura em produtos oleoquímicos, teve, nos últimos anos, um crescimento de sua oferta com conseqüente diminuição de seu preço no mercado. Assim, embora esta metodologia tenha sido pouco aplicada (WOLFSON e DLUGY, 2009), a reação de redução de compostos carbonilados aos álcoois correspondentes, utilizando glicerol como meio reacional, apresenta-se como uma alternativa viável.
Os substratos e produtos foram caracterizados por espectrofotometria no infravermelho (IV) (espectros em ANEXO), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) (espectros em ANEXO), polarimetria e cromatografia gasosa de alta resolução com uso de colunas contendo fases estacionárias quirais.
Após identificação dos resultados de conversão, excesso enantiomérico e configuração dos isômeros dos β-hidroxiésteres obtidos por biorredução, realizou-se o mapeamento das características moleculares dos beta-cetoésteres e dos beta-hidroxiésteres correspondentes, de maneira a avaliar a relação da estrutura destes com a configuração do enantiômero formado pelo biocatalisador, por técnicas de modelagem molecular.
5.1 BIORREDUÇÃO E REDUÇÃO QUÍMICA DE 3-OXOBUTANOATO DE ETILA (1)