MODELAGEM MOLECULAR

Os estudos in silico dos análogos da capsaicina foram realizados em colaboração com a Prof. Dra. Kerly Mesquita Pasqualoto. Inicialmente, realizou-se a construção dos modelos moleculares tridimensionais destes compostos, subsequente cálculo de propriedades moleculares e análise exploratória dos dados. É importante ressaltar que somente 11 compostos (seis amidas e cinco ésteres) foram modelados juntamente à capsaicina, sendo estes: RPF452, RPF456, RPF459, RPF401, RPF404, RPF351, RPF353, RPF303, RPF304, RPF305 e RPF306.

Nesta etapa foi utilizado computador com sistema operacional Windows de configuração Intel® Core i7TM 2.40 GHz, RAM 6.0 GB.

5.5.1 Construção dos modelos moleculares tridimensionais (3D)

Os modelos moleculares 3D dos 11 compostos das duas séries e da capsaicina foram construídos, inicialmente, no programa Hyperchem 8.0 (Hypercube, Inc: 2008. Gainesville, FL, EUA). Utilizou-se como geometria de partida para os análogos pertencentes às séries I e II, a estrutura cristalografada da N-(benzo[d][1,3]dioxol-5- ilmetil)-4-metilbenzamida (Maganhi et al., 2013). Já a capsaicina foi construída a partir

do cristal da 3-cloro-N-(4-hidroxi-3-metoxi-benzil)-2,2-dietilpropanamida (Huang et al., 2010).

A otimização de geometria foi realizada em campo de força empírico MM+ (derivado do MM2) (Allinger, 1977) (programa Hyperchem 8.0). As cargas atômicas parciais de ponto único foram calculadas para as estruturas com o método de mecânica quântica, semi-empírico Hamiltoniano AM1 (Austing Model 1) (Dewar et al., 1985).

Subsequentemente o programa MOLSIM 3.2 (Doherty, 2002; MOLSIM 3.2; The

Chem21 Group, Inc: 1997, Lake Forest, IL, EUA), disponibilizado pelo Prof. Titular

Leoberto Costa Tavares, foi utilizado para minimização de energia dos modelos moleculares 3D das estruturas. Utilizaram-se os métodos de declive máximo (steepest

descent) e de gradientes conjugados (conjugated gradient) com critério de convergência

de 0,01 kcal/mol.

As estruturas minimizadas seguiram para as simulações de dinâmica molecular (DM) de 1 ns (1.000.000 passos, cada passo de 1 fs), 310 K (37 °C), a fim de gerar um perfil de amostragem conformacional (PAC). Foi utilizada a constante dielétrica de 3,5 para simular o ambiente das membranas biológicas e o sítio de interação com o alvo biológico. Foi necessário adotar restrição de posição para alguns átomos a fim de manter a integridade estrutural dos modelos pela atribuição de massas fictícias de 5.000 u.m.a. Os arquivos trajetória foram salvos a cada 20 passos de simulação, resultando assim em 50.000 confôrmeros (PAC). Os confôrmeros de menor energia do PAC foram selecionados e comparou-se com o modelo molecular inicial e com o minimizado no intuito de verificar a integridade estrutural após a DM. O critério utilizado foi o valor do desvio quadrático médio de posições atômicas (RMSD, root-mean-square deviation). Quanto menor o valor de RMSD mais semelhantes são as estruturas. Esta medida

juntamente com a verificação da conformação mais frequente decorrente das simulações, ajudou na escolha do confôrmero de energia mais baixa para prosseguimento dos estudos. Desta forma, os confôrmeros selecionados foram submetidos novamente à minimização no programa MOLSIM 3.2.

5.5.2 Cálculo das propriedades moleculares

As propriedades termodinâmicas, obtidas com o programa MOLSIM 3.2, foram as seguintes: contribuições de energias intramoleculares de deformação axial (ESTRETCH), deformação angular (EBEND), deformação torsional (ETORS), interações do

tipo 1-4 (E1-4), interações de van der Walls (EvdW), interações de energia eletrostática

(ECHARGE), ligação de hidrogênio (EligH), solvatação (Esolv), utilizando o modelo de

camada de hidratação proposto por Forsythe e Hopfinger (1973), e energia potencial total (ETOT), que corresponde à somatória de todas as energias de contribuição

intramolecular listadas anteriormente. As contribuições de energia intramolecular de ligação de hidrogênio e solvatação foram obtidas realizando-se uma simulação curta a 310 K com constante dielétrica de 3,5 e para o cálculo de Esolv utilizou-se como solvente

a água.

As propriedades eletrônicas foram calculadas com o programa Gaussian 03W (Gaussian 03W for Windows, version 6; Gaussian Inc.: 1995-2003, Pitsburgh, PA, EUA). Calcularam-se as cargas parciais atômicas ajustadas pelo potencial eletrostático (CHELPG, Charges from Electrostatic Potentials using Grid based method) (Breneman, Wiberg, 1990), momento de dipolo (total e nos eixos x, y, z) e energia de orbitais moleculares de fronteira (EHOMO e ELUMO), empregando o método funcional

Calculou-se com o programa Marvin Beans (Marvin Beans, version 5.0.4.1; ChemAxon Ldt.: 1998-2010, Budapeste, Hungria) as propriedades estéricas, topológicas e o ClogP, sendo este calculado pelo método de pesos do programa, que atribui pesos iguais para os métodos de Visvanadhan et al., 1989, Klopman et al., 1994 e da base de dados PHYSPROP.

Além disso, outras propriedades estéricas foram calculadas aplicando o programa Hyperchem 8.0 (Hypercube, Inc: 2008. Gainesville, FL, EUA): área superficial aproximada (SAaprox), área superficial pelo método de grid (SAgrid), volume,

massa, energia de hidratação (Ehidr) e polarizabilidade (α). Informações sobre os

programas utilizados para realização dos cálculos serão detalhadas no item 6.5.2.

Uma tabela contendo 12 linhas, correspondentes às amostras (cinco moléculas pertencentes à série I, seis moléculas da série II e a capsaicina) e 48 colunas, correspondentes aos descritores moleculares foi construída e utilizada na análise exploratória de dados. Devido as diferentes ordens de magnitude entre as variáveis calculadas, o auto-escalamento foi empregado como pré-processamento dos dados.

As propriedades calculadas estão listadas no anexo 3 “Propriedades moleculares calculadas”.

5.5.3 Análise exploratória de dados: HCA e PCA

A etapa que consiste na análise exploratória de dados foi realizada no programa Pirouette 3.11 (Pirouette 3.11, Infometrix Inc., 1990-2003, Woodinville). A análise de HCA foi desenvolvida com método de agrupamento completo e as distâncias entre as amostras foram calculadas por meio da distância Euclidiana. Os dados foram apresentados em um gráfico bidimensional denominado dendrograma. As distâncias

calculadas entre as amostras foram definidas em uma matriz de similaridade cujos elementos são os chamados índices de similaridade que variam de 0 a 1, sendo 1 o valor de máxima similaridade (Pirouette, 2003; Moita Neto, Moita, 1998; Beebe, Pell, Seasholtz, 1998). O HCA foi realizado para as amostras sendo que estas são dispostas no eixo vertical do dendrograma, enquanto o índice de similaridade é observado no eixo horizontal.

Para a análise de PCA, os dados originais foram decompostos em duas matrizes, uma de escores, relacionando os compostos, e outra de pesos (loadings), relacionando as variáveis (Montanari, 2011; Ferreira, 2002; Beebe, Pell, Seasholtz, 1998). O direcionamento do estudo visou estabelecer a importância das propriedades físico- químicas para discriminação das estruturas e para o reconhecimento molecular.