Modelagem por substituição quimérica

O alinhamento das sequências primárias das duas proteínas foi feito no programa NCBI BLASTP 2.2.17 [ALTSCHUL et al., 1997] pela rede de serviços BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponível no sítio do Swiss-Prot. Estas sequências apresentam 27%

de identidade e 46 % de similaridade entre os aminoácidos, como representado na figura 9.

CYP51MG_{: 72 DPYKFFFSCREKYGDVFTFILLGKKTTVCLGTKGNDFILNGKLKDVNAEEIYSPLTTPVF 131} CYP51MT_{: 25 DPIGLMQRVRDECGDVGTFQLAGKQVVLLSGSHANEFFFRAGDDDLDQAKAY-PFMTPIF 83} * * ** * CYP51MG_{: 132 GKDVVYDCPNSKLMEQKKFVKYGLTTSALQSYVTLIAAETRQFFDRNNPHKKFASTSGTI 191} CYP51MT_{: 84 GEGVVFDASPERRKE--MLHNAALRGEQMKGHAATIEDQVRRMIAD---WGEAGEI 134} ** ** CYP51MG_{: 192 DLPPALAELTIYTASRSLQGKEVREGFDSSFADLYHYLDMGFTPINFMLPWAPLPQNRRR 251} CYP51MT_{: 135 DLLDFFAELTIYTSSACLIGKKFRDQLDGRFAKLYHELERGTDPLAYVDPYLPIESFRRR 194} CYP51MG_{: 252 DYAQKKMSETHMSIIQKR---RESKRANMRKTTSRCKYKDGN-AIPDKEIAHMMIALL 305} CYP51MT_{: 195 DEARNGLVALVADIMNGRIANPPTDKSDRDMLDVLIAVKAETGTPRFSADEITGMFISMM 254} CYP51MG_{: 306 MAGQHSSSATESWITLRLASRPDIQDELLQEQKDMLGVNADGSIKELTYANLSKLTLLNQ 365} CYP51MT_{: 255 FAGHHTSSGTASWTLIELMRHRDAYAAVIDELDELYG---DG--RSVSFHALRQIPQLEN 309} *** ** CYP51MG_{: 366 VVKETLCIHAPIHSILRKVKSPMPIEGTAYIIPTTHTLLAAPGTTSRMDEHFPDCLHWEP 425} CYP51MT_{: 310 VLKETLRLHPPLIILMRVAKGEFEVQG--HRIHEGDLVAASPAISNRIPEDFPDPHDFVP 367} * * CYP51MG_{: 426 HRWDESPSEKYKHLSPTTALGSIAEEKEDYGYGLVSKGAASPYLPFGAGRHRCIGEQFAY 485} CYP51MT_{: 368 ARYEQPRQE---DLLNRWT---WIPFGAGRHRCVGAAFAI 401} * * CYP51MG_{: 486 VQLQTITATMVRDFKFYNVDGSDNVVGTDYSSLFSRPLSPAVVKW 530} CYP51MT_{: 402 MQIKAIFSVLLREYEFEMAQPPES-YRNDHSKMVVQLAQPACVRY 445} *

Figura 9. Alinhamento das estruturas primárias da CYP51 de M. graminicola (CYP51MG) e M. tuberculosis (CYP51MT). Os aminoácidos conservados estão destacados em azul; os que

apresentam características semelhantes, em cinza; os asteriscos indicam quais aminoácidos que fazem parte do sítio de interação das duas proteínas, selecionados a partir de 4,5Å do fluconazol, na estrutura CYP51MT.

A substituição dos aminoácidos do sítio ativo da CYP51MT pelos aminoácidos da CYP51MG foi feita no programa Swiss-Pdb Viewer 3.7 [GUEX E PEITSCH, 1997], utilizando-se a ferramenta “mutate”. A escolha da conformação das cadeias laterais dos aminoácidos substituídos foi baseada no “score” fornecido pelo próprio programa. O “score” dá uma pontuação para as possíveis conformações dos aminoácidos dentro da enzima, considerando os efeitos de repulsão de van der Waals e as ligações hidrogênio. Quanto menor o “score” calculado para uma dada conformação de um aminoácido, maior a possibilidade de ser esta a sua conformação dentro da enzima. Neste estágio, não houve modificação na conformação dos aminoácidos que permaneceram conservados entre as duas proteínas.

A seguir, foram feitas as seleções nominais dos aminoácidos, das moléculas de água, do heme e do fluconazol, presentes no sítio ativo da quimera, utilizando o programa Rasmol, tomando como base a nova nomenclatura que os aminoácidos receberam após a mutação (tabela 7).

Tabela 7. Nomenclatura dos aminoácidos presentes no sítio ativo da CYP51MG após a

substituição de alguns resíduos da CYP51MT.

CYP51MT CYP51MG CYP51MT CYP51MG CYP51MT CYP51MG

Gln 72 Ala 72 Met 99 Lys 99 Leu 321 Ile 321

Tyr 76 Tyr 76 Leu 100 Phe 100 Arg 326 Arg 326

Phe 78 Leu 78 Phe 255 Met 255 His 392 His 392

Met 79 Thr 79 Ala 256 Ala 256 Cys 394 Cys 394

Phe 83 Phe 83 Gly 257 Gly 257 Met 433 Leu 433

Arg 95 Lys 95 His 259 His 259

Arg 96 Leu 96 Thr 260 Ser 260

4.4 Otimização dos Sítios CYP51MT e CYP51MG com o Fluconazol

Uma vez definida a estrutura do sítio ativo da CYP51MT e CYP51MG (com o fluconazol) foi feito a otimização de suas geometrias. Uma vez que os arquivos fornecidos pelo PDB contêm apenas as coordenadas cartesianas dos átomos pesados, fez-se necessário inserir os átomos de hidrogênio nestas estruturas e fazer a conversão para coordenadas internas, gerando um arquivo no formato de entrada do Mopac2007. Estas alterações foram feitas pelo programa de conversões de arquivos BABEL [WALTERS & STAHL, 1996], em ambiente DOS. Durante esta alteração, átomos de hidrogênio são inseridos nos átomos (C e N) que tiveram sua ligação peptídica rompida ao serem selecionados para compor o sítio ativo destas enzimas. Isso fez que o número de ligações se mantivesse constantes nestes átomos.

Os resíduos de histidina foram considerados na forma neutra enquanto que os resíduos de arginina foram considerados protonados (forma catiônica), visto que os resíduos Arg95 e Arg326, presentes na CYP51MT, parecem interagir com os carboxilatos do heme por meio de uma interação iônica (figura 10).

Há resíduos de lisina no sítio ativo de CYP51MG; em solução, a lisina estaria normalmente na forma protonada, mas dependendo do microambiente em que o resíduo se localiza no interior da enzima, tanto a forma neutra quanto protonada são possíveis. Na

enzima ácido graxo amida hidrolase, por exemplo, foi demonstrado que um resíduo de lisina do sitio ativo deve estar na forma neutra para iniciar o ciclo catalítico de hidrólise do substrato [MCKINNEY e CRAVATT, 2003]; resíduos de lisina tanto na forma neutra quanto protonada foram identificados por difração de neutrons na enzima D-xilose isomerase [KATZ et al., 2006]. Assim, o resíduo Lys95 foi considerado protonado (com um grupo NH3+-terminal),

pois assim também poderia fazer uma interação iônica com um carboxilato do heme, de modo similar ao resíduo Arg95 de CYP51MT, mas o resíduo Lys99 foi avaliado tanto na forma protonada quanto na forma neutra, ou seja, com um grupo NH2-terminal. O estado de

protonação deste resíduo poderia influenciar bastante os resultados obtidos, visto que esse resíduo faz parte de uma importante região do sítio ativo que vai interagir com o único grupamento dos triazóis que sofrerá modificação estrutural durante os estudos (o grupo fenila). Por esta razão, foram criados dois modelos para a CYP51MG: um modelo com Lys95 protonada e a Lys99 desprotonada, CYP51MGSQ1; e outro com as duas lisinas protonadas, CYP51MGSQ2.

Figura 10. Sítio de ativo da CYP51MT. Moléculas de água e átomos de hidrogênio foram

omitidos. As cores representadas para os átomos são: nitrogênio, em azul; oxigênio, Arg96 Met99 Arg326 Arg95 Cys394 Fluconazol

vermelho; carbono, branco; enxofre, amarelo; flúor, azul-claro. O ferro está sendo representado pela esfera amarela. Os carbonos do inibidor (fluconazol) estão em ciano.

Propostas mecanísticas para a oxidação de substratos pela P450 sugerem que a carga do íon ferro do heme antes da ligação dos substratos é de +2 [GUENGERICH, 1991; WERCK-REICHHART & FEYEREISEN, 2000]. Como o resíduo Cys394, que atua como o quinto ligante para o ferro, foi considerado desprotonado (forma aniônica) e o anel protoporfirínico do heme apresenta dois substituintes carboxilato em sua estrutura (Figura 9), a carga eletrônica total atribuída às estruturas CYP51MT, CYP51MGSQ1 e CYP51MGSQ2 foi de +2, +1 e +2, respectivamente.

A definição do estado de spin do átomo de ferro foi baseada na geometria da estrutura cristalográfica do heme da CYP51MT. Mudanças estruturais verificadas por métodos de difração de raios-X demonstram que complexos heme penta-coordenado de Fe (II) sempre apresentam configuração de alto spin ( 4 2

2geg

t ). Neste caso, o diâmetro do íon Fe (II) é maior

que o orifício central do anel porfirínico e, consequentemente, o Fe (II) encontra-se fora do plano do anel. Quando o Fe (II) completa a hexa-coordenação e o complexo passa para a configuração de baixo-spin ( 6

2 g

t ), o íon Fe (II) reduz seu volume, movendo-se para dentro do

plano do anel [SHRIVER et al., 1994]. Baseado nestas informações e analisando a geometria do heme na CYP51MT (figura 10), os cálculos de otimização das geometria da CYP51 foram feitos considerando-se o Fe (II) no estado de baixo-spin (neste caso, sem elétrons desemparelhados).

Os átomos que compõe a ligação peptídica dos aminoácidos foram fixados no espaço. Os átomos das cadeias laterais, de cada inibidor, das moléculas de água e todos os hidrogênios foram mantidos livres durante a otimização. Os quatro átomos de carbono do heme responsáveis por unir um anel pirrólico a outro também tiveram suas coordenadas fixadas com o intuito de se evitar um possível deslocamento do heme (figura 11).

Figura 11. Representação da estrutura do heme presente na CYP51. Os asteriscos indicam

quais carbonos tiveram suas posições “congeladas”.

Estas estruturas foram otimizadas com o programa Mopac2007, utilizando-se as palavras-chave: “PM6 GRAD NOINTER NOLOG EF MMOK T=3D CHARGE=n GNORM=1”, onde n corresponde à carga resultante das estruturas.