CAPÍTULO I REVISÃO DA LITERATURA
1. O fenómeno do envelhecimento humano e Gerontologia Social
2.4. Modelo da Solidariedade e Ambivalência intergeracional
Voir l’article intitulé "Production of dog calcyphosine in bacteria and lacks of phosphorylation by the catalytic subunit of protein kinase A in vitro" de El Housni et al. (1997) en annexe.
6. Marquage à Piode-125 de la calcyphosine de chien
La réaction est effectuée dans im volume final de 60 pl composé de: tampon phosphate 50 mM pH 7.4, CaCb 0.4 mM, 7 pg de calcyphosine recombinante, 0.1 mM H2O2, 200 pCi Na‘^^1 (2000Ci/mmol) et 6.2 pM Kl.
Le rajout d’ipg de lactoperoxydase démarre la réaction; celle-ci est effectuée pendant 7 minutes à température ambiante avant de rajouter 0.07 mM d’H202 pour 7 minutes de plus. La réaction est arrêtée à l’aide de 5 pl de DÎT 10 % et le milieu réactionnel est porté à 500 pl par addition de Tris-HCl 50 mM pH 7.5, ImM CaCL avant d’être déposé sur coloime phényl-sépharose CLL4B conditionnée au préalable avec 20 ml du même tampon.
La colonne est chargée avec 40 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7.5, ImM CaCL; on receuille 40 fi'actions de 1 ml dont les 30 premières ne sont pas comptées. L’élution de la calcyphosine se fait dans un tampon Tris HCl 50 mM pH 7.5 contenant 1 mM en EGTA
Matériel et méthodes
et 30 fractions d’I ml sont recueillies et comptées. Les fractions d’intérêt sont rassemblées et ajoutées au milieu d’incubation utilisé en "overlay".
7. Overlay
150 |ig et 75 pg d’un extrait protéique total respectivement de tissu thyroïdien de chien et de cellules thyroïdiennes en culture primaire stimulées 24 heures à la forskoline, sont déposés sur gel SDS-PAGE. Après migration, les protéines sont transférées sur filtre de nitrocellulose et celui-ci est déposé 2 heures dans la solution A: 50 mM TrisHCl pH 7.5 - 0,2 M NaCl -1 mM CaCb - 0,05 % Tween 20.
Ensuite, les filtres sont mis en présence de la même solution d’interaction contenant l’équivalent de la moitié de la préparation de calcyphosine marquée (voir point n° 6 ci- dessus) et d’un excès de quarante fois de calcyphosine recombinante froide pour le filtre "compétition". L’incubation est effectuée pendant deux heures et les filtres sont ensuite lavés 6x10 minutes dans la solution A avant d’être exposés pour autoradiographie.
Toutes les incubations sont effectuées à température ambiante.
8. Synthèse de la banque d’ADN complémentaire
La synthèse de la banque d’ADN complémentaire a été réalisée à l’aide du kit Gibco (référence catalogue 8248 RT) avec im amorçage dirigé "oligo dT" et l’introduction d’adaptateurs Sali et Notl respectivement en 5’ et 3’. Cette synthèse a été réalisée au départ de 5pg d’ARN messager poly A+ de tissu thyroïdien de chien et 1 pg d’ADN complémentaire double-brin a été récupéré. Une des étapes de la synthèse de la banque exigeant un passage sur colonne de chromatographie d’exclusion (afin d’isoler des fractions contenant des ADNc non pollués par des nucléotides ou des amorces non incorporées ou encore de trop petits fragments d’ADN), certaines fractions ont été groupées entre elles pour former deux populations contenant des fragments de taille moyenne différentes.
9. Préparation du vecteur pour le clonage de la
banque
20^g de vecteur pPC86B (généreusement fourni par D. Perez-Morga) sont digérés par 150 unités d’enzyme EcoRI; après inactivation de l’enzyme 15 minutes à 65° C, le vecteur est déphosphorylé par 2 unités de CI AP (Gibco BRL 18009-027), puis l’enzyme est inactivé 10 minutes à 65° C après ajout d’EGTA à 20 mM final.
L’ADN est digéré par 75 unités d’enzyme Notl puis par 100 unités de l’enzyme SaH. Tous les temps d’incubation sont de deux heures à 37° C et entre chacime des étapes, une extraction phénol-chloroforme et une précipitation de l’ADN sont réalisées.
La ligation des ADNc dans le vecteur a été réalisée selon im rapport molaire approximatif de 1 :1. Après électroporation et étalement des bactéries sur milieu LB-ampicilline 50 pg/ml, celles-ci sont récupérées par grattage des boîtes dans 10 ml de LB. L’ADN plasmidique est extrait de la suspension bactérienne selon le protocole du kit Nucleobond AX500 PC-Kit (Macherey-Nagel).
10. Electroporation
Le protocole de préparation des bactéries est adapté de Zabarovky (1990); T électroporation est effectuée selon les paramètres suivants: 1.7 kV - 200Q - 25pF, dans des cuvettes possédant une distance interélectrodes de 0,1 cm
11. Transformation de levure
Le protocole final à l’acétate de lithium est adapté de Gietz R.D. (Gietz et al. 1996).
12. Milieux de culture des levures
La composition des milieux de croissance et de sélection des levures provient de Gietz R.D. (Gietz et al. 1997).
Matériel et méthodes
13. Préparation d’ADN plasmidique et de protéines de
levure
Le protocole suivi est adapté de Hofftnan C.S. (1997).
14. Criblage de banque par la méthode du ”double-
hybride”
Les souches de levures sont transformées, dans un premier temps, par la construction pPC97 dans laquelle a été clonée la séquence codant pour la protéine d’intérêt.
Dans im deuxième temps, la banque d’ADNc, clonée dans le vecteur pPC86B, est électroporée dans les levures, à raison de 10 pg par criblage.
Dans le cas de la souche PCY2, les transformants sont étalés sur milieu carencé en tryptophane et leucine à raison de 50.000 transformants par boîte carrée 22 x 22 cm.
La détection de l’activité p-galactosidase est réalisée comme décrit par Chevray et al. (1992). Pour la souche Y153, le milieu est en plus carencé en histidine et supplémenté avec 10 mM de 3-amino-l,2,4- triazole (3-AT), et les transformants sont étalés à raison de 400.000 par boîte carrée. Au cours des tours de purification, cette concentration en 3-AT peut être augmentée jusqu’à 30-50 mM.
15. Séquençage
Tous les séquençages réalisés dans ce travail ont été effectués à l’aide du "DNA Sequencing Kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Part n.402079 Applied Biosystems".
16. Criblage de la banque de phage A.-gtll
La banque de phage X,-gtll utilisée a été synthétisée par A. Lefort à partir d'ARN messager de tissu thyroïdien de chien (Lefort et al. 1989).
Le criblage a été réalisé selon le protocole décrit dans le Maniatis chap. 2; après avoir subi quatre lavages à 42° C, 2x SSC, 0.1 % SDS et deux lavages à 65° C, O.lx SSC, 0.1 % SDS, d’1/4 heure chacun, les filtres sont séchés et exposés pour une nuit à -70°C avec écran renforçateur. La sonde utilisée pour ce criblage a été réalisée à partir du clone P0071 partiel de chien isolé lors du criblage "double-hybride" et excisé du vecteur pPC86
par les enzymes Sali et Notl. Le protocole suivi est tiré de "Molecular Cloning; a laboratory manual. Sambrook,Fritsch and Maniatis; second édition", chapitre 10-13: "synthesis of uniformly labelled DNA probes using random oligonucleotides primers".
17. Préparation d’ADN de bactériophage X
Le protocole utilisé pour préparer l’ADN de phage
X
est adapté de "Molecular Cloning; a laboratory manual. Sambrook,Fritsch and Maniatis; second édition" chap.2-118.18. RT-PCR
Le protocole suivi est adapté de Hoffman et al. (1996) et réalisé sur 250ng d'ARNm polyA+ de tissu thyroïdien de chien. Les amorces 5’CAA CCG AGC ATC TTG ACG 3’ (18-mer) et 5’ AAA AAG GAT GGG TGG AAT 3’ (18-mer) ont été utilisées pour la réaction PCR. effectuée dans les conditions suivantes: 93° C (2 min. 30 sec.), (93° C (50 sec.), 50° C (50 sec.), 72° C (1 min. 30 sec.)) x 30, 72° C (6 min.), 15° C (fin).
19. Northern Blotting P0071
Les cultures primaires de cellules thyroïdiennes sont obtenues en suivant le protocole de Roger et al. (1982). Les cellules sont placées en milieu contrôle insuline quatre jours, suivi d'une stimulation à la forskoline (10 pM) pendant 24 heures.Les différents tissus sont, quant à eux, découpés finement et broyés dans l’azote liquide.L’extraction d’ARN total est réalisée selon le protocole de Chirgwin et al. (1979) et 8 pg sont déposés par piste. L’ARN total des différents tissus de chien a été fourni par Adrian Radulescu.
Matériel et méthodes
Pour l’expérience nécessitant l’utilisation d’ARN messager polyA+, celui-ci est extrait des différents ARN totaux nécessaires à l’aide du kit "PolyA Ttract® mRNA isolation System IV" (Promega, cat. Z5310), et déposés à raison d’1.5 pg par piste. Le dépôt des échantillons et l’électrophorèse sont réalisés selon Mc Master et al. (1977), le transfert selon Thomas et al. (1980) et l’hybridation selon Feinberg et al. (1983).
La sonde est réalisée au départ de la séquence originale mise en évidence lors du criblage "double-hybride", excisée du vecteur pPC86A par les en2ymes Sali et Notl.
Le protocole de marquage est le même que celui décrit dans le chapitre
"Criblage de la
banque de phage À-gtll".
Après trois lavages de dbc minutes à température ambiante, SSCx2, SDS 0.1 % et trois lavages de vingt minutes à 65° C, SSC x 0.1, SDS 0.1 %, les filtres sont séchés et exposés à - 70° C pour des durées variables.20. Construction d’expression dans le vecteur pMal-
cRI®
Les premières étapes du clonage ont été réalisées comme décrites dans l’annexe "clonage de la phase codante complète de P0071 dans le vecteur pPC86A". L’insert codant la protéine P0071 de chien complète est excisé du vecteur pTrcHisA® (Invitrogen) par les enzymes BamHI et HindlII et cloné via les mêmes sites dans le vecteur pMal-cRI (Biolabs).
Cette construction, ainsi que le vecteur sans insert ont servi à transformer la souche de bactérie
E. coli
HB101.La mise au point de l’expression protéique ainsi que la purification de la protéine de fusion ont été réalisées selon le protocole décrit par la firme Biolabs pour l’utilisation de son vecteur. Le dosage de la concentration protéique des différents échantillons obtenus après passage sur colonne amylose se fait selon la méthode sur filtre de papier (Minamide et al. 1990). Les gels de protéine SDS-PAGE sont réalisés sur VERTICAL SLABGEL UNIT MODEL SE 400 THE STURDIER, à l’aide d’espaceurs 1.5 mm, selon le protocole décrit dans Harlow E. et al. (1988).
L’immunodétection est réalisée à l’aide de l’anticorps primaire anti-MBP (Biolabs, cat. 800-30) à la dilution 1/5 000. La révélation est effectuée à l’aide du kit ECL d’Amersham (Amersham, cat. RPN 2108).
21. Construction d’expression dans le vecteur
PET28A®
Le détail de la construction est présenté dans l’annexe: "Clonage de la phase codante complète de P0071 dans le vecteur pPC86A".
Cette construction ainsi que le vecteur sans insert ont servi à transformer la souche de bactérie
E.coli
BL21 DE3. La mise au point de l’expression protéique a été réalisée selon un même schéma que celui appliqué pour le vecteur d’expression pMal-cRI. La lyse des cellules après induction est effectuée de la feçon suivante: 100 ml de culture induite, centrifugée 5 minutes à 6000 xg, 4° C, est resuspendue dans 10 ml d’une solution 20 mM tampon phosphate pH8, 500 mM NaCl, 100 pg/ml lysosyme et laissée 15 minutes sur glace. L’échantülon est ensuite soniqué 6x15 secondes, puissance 5 à l’aide d’un sonicateiu- "Vibra Cell". 2 étapes de gel-dégel (azote liquide - 37° C) sont ensuite réalisées et l’échantillon est centrifugé à 10 000 xg, 4° C pendant 20 minutes. Après décantation du surnageant, le culot est resuspendu dans 10 ml de la solution de départ.l/500ème de cette suspension est déposé sur gel de protéine SDS-PAGE.
L’immunodétection est réalisée à l’aide de l’anticorps monoclonal primaire anti-His de souris (Clontech) à la dilution de 1/5 000. La révélation est effectuée à l’aide du kit ECL d’Amersham (RPN 2108).
22. Obtention d’anticorps
Seule la stratégie impliquant la protéine recombinante MBP-P0071 sera décrite ici.
Le protocole suivi a nécessité 3 injections intradermiques à un lapin de la protéine recombinante, à raison de 60 pg par injection tous les quinze jours.
Les injections ont été réalisées en présence d’un volume égal d’Adjuvant de Freund complet pour la première et incomplet pour les deux autres.
20 ml de sang total, prélevés avant la première injection et 15 jours après la dernière, sont laissés à 4° C pour la nuit, centrifugés 5 minutes à 5 000 xg et le surnageant est récupéré et conservé à - 20° C. Le sérum est utilisé à une dilution de 1/200 et les immunodétections sont réalisées à l’aide du kit Amersham ECL.
Matériel et méthodes
23. Purification de l’anticorps
Le protocole utilisé pour purifier l'anticorps est adapté de: Harlow E. and Lanes D. (1998) Immunoblotting, in Antibodies: A laboratory manual Chap. 12 Cold Spring Harbor Laboratory N-Y
24. Préparation d’extraits protéiques totaux de cellules
ou tissu
a) Cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire: les cultures sont effectuées d’une manière identique à celle décrite dans le chapitre 19 "Matériel et méthodes". Après les 24 heures de stimulation à la Forskoline, le milieu de culture est aspiré, et les cellules sont grattées dans 1ml de PBS par boîte de 10 centimètres de diamètre. La suspension est centrifugée ime minute à 13 000 xg, le surnageant éliminé et le culot repris dans 150 pl de tampon Laemmlli (Harlow E. et al. 1988) sans bleu de bromophénol.
b) Cellules COS transfectées (chapitre 30 "Matériel et méthodes"); 48 heures après la transfection, le milieu de culture est aspiré, les cellules sont lavées à l’aide de 10 ml de PBS par boîte de 10 centimètres de diamètre et grattées dans 1 ml de tampon Laemmli sans bleu de bromophénol.
c) Tissu thyroïdien de chien: 50 mg de tissu thyroïdien de chien en suspension dans 2 ml de tampon Laemmlli sans bleu de bromophénol sont homogénéisé pendant 5 minutes dans un homogénéisateur verre-verre puis transféré dans un Ependorff.
Tous les échantillons sont bouillis 3 minutes puis centrifugés 5 minutes à 13 000 xg et le surnageant est récupéré. Les extraits sont déposés sur gel SDS-PAGE après avoir été dosés par la méthode sur filtre de papier (Minamide et al. 1990).
25. Clonage de la séquence codant la P0071 de chien
dans le vecteur pEGFPCl
Les premières étapes du clonage ont été réalisées comme décrites dans l’annexe, chapitre "Clonage de la phase codante complète de P0071 dans le vecteur pPC86". L’insert codant la protéine P0071 de chien complète est excisé du vecteur pTrcHisA® (Invitrogen) par les enzymes BamHI et HindlII et cloné dans le vecteur pEGFPCl via les sites BgUI-Hindin. Les régions de clonage ont été vérifiées par séquençage.
26. Transfection des cellules COS par la construction
PEGFPC1-P0071
Le protocole utilisé est adapté de Christophe-Hobertus et al. (1999).
Le contrôle positif de localisation nucléaire est présent sous la forme de la construction pEGFPCl-hd TTFl et les quantités d’ADN engagées sont de 500ng par boîte de 3 cm de diamètre.
27. Clonage de la séquence codant la protéine C3VS
dans le vecteur d’expression pGex4T-2
La séquence codante de la protéine C3VS est obtenue en l’excisant du vecteur pPC97 utilisé pour le "double-hybride", à l’aide des enzymes EcoRI et Sacl puis clonée dans le vecteur pET 22b (Novagen ref 69744-3) qui sert d’intermédiaire. Les enzymes EcoRI et Notl sont alors utilisés pour ressortir l’insert et le cloner dans le vecteur pGEX 4T-2 préparé de la même façon.
Cette construction finale est introduite par électroporation dans la souche de bactérie
E.
coli
BL21.Matériel et méthodes
28. Expression et purification de la protéine de fusion
GST-C3VS
La mise au point de l’expression de la protéine de fusion a été effectuée en suivant la même démarche que celle appliquée pour toutes les autres fusions pré-citées.
Afin de purifier la protéine de fiision, 20 ml de culture de bactéries transformées par la construction permettant l’expression de la protéine de fusion GST-C3VS sont induites, en phase exponentielle, par 0.1 mM d’IPTG pendant 4 heures à 30° C sous agitation constante. Après induction, les bactéries sont culotées par centrifugation à 6 000 xg pendant 5 minutes, puis resuspendues dans 1 ml de PBS contenant 50 pg de Pefabloc et 5 pM de Leupeptine. L’échantillon est soniqué 4 x 10 secondes puissance 4 à l’aide d’une microsonde (Vibra Cell), puis centrifugé 5 minutes à 13 000 xg.
Le surnageant est récupéré et mis en présence de 50 pl de résine glutathion-sépharose 50 % (Sigma, cat. G4510) pendant deux heures sous agitation à 4° C. Les billes sont ensuite centrifugées 10 secondes à 13 000 xg et lavées 3 fois à l’aide soit de 500 pl du tampon "TNT": tampon PBS + 0.1 % NP40 + 50 pg/ml de Pefabloc et 5 pM final de Leupeptine, soit de 500 pl de tampon "extrait COS": 50 mM TrisHCl pH7.5, 150 mM NaCl, 0.5 % NP40, 50 pg/ml Pefabloc et 5 pM final de Leupeptine selon le type de "GST-pulldow assay" réalisé (voir chapitre 32 "Matériel et Méthodes").
La même démarche est suivie pour les bactéries transformées par la construction sauvage permettant l’expression de la protéine GST seule.
29. Clonage des séquences codant la P0071 complète et
partielle dans le vecteur pCDNA3HisC
La séquence codant la P0071 de chien complète est obtenue à partir de la construction pET28A® en clivant à l’aide des enzymes BamHI et Notl. Ces mêmes sites de restriction servent à cloner cet insert dans le vecteur pCDNA3HisC. La séquence codant la P0071 de chien partielle est obtenue à partir de la construction pET28A® -P0071 partielle (ADNc ne contenant pas les séquences situées au-delà du sbdème motif "armadillo") décrite dans l’annexe, chapitre "Construction des mutants de P0071 pour le "double-hybride" par
clivage à l’aide des enzymes BamHI-Notl. Ces mêmes sites de restriction servent à cloner cet insert dans le vecteur pCDNA3HisC.
30. Transfection des cellules COS
Les transfections sont réalisées à l’aide de FUGENE6 (Boehringer Mannheim, cat. 1 814 443) selon le protocole décrit par la firme. Les quantités d’ADN engagées sont de 5 pg par construction, par boîte de 10 cm de diamètre. Les cellules COS sont transfectées à environ 75 % de leur confluence. Les extraits protéiques pour l’immimodétection directe sont réalisés comme décrit au chapitre 24 "Matériel et Méthodes".
Les extraits protéiques pour les expériences de "GST-pulldown assay" sont préparés de la façon suivante: après 48 heures de transfection, 4 boîtes de 10 cm de diamètre de cellules COS transfectées par la construction permettant l’expression de la protéine P0071 complète ou partielle sont débarassées de leur milieu de culture et lavées avec 10 ml de tampon PBS. Le milieu de lavage est alors éliminé et remplacé par 300 pl de tampon "extrait COS" (chapitre 28 "Matériel et méthodes"), dans lequel les cellules sont récupérées à l’aide d’un grattoir en caoutchouc. Les quatre surnageants sont rassemblés et passés ime vingtaine de fois à l’homogénéisateur verre-verre. Après un passage de 10 minutes sur une plaque vibrante à 4° C, les échantillons sont centrifugés 10 minutes à 13 000 g à la même température. Le surnageant est alors récupéré et utilisé pour les expériences.
31. Production de la P0071 de chien complète et
partielle en système de transcription-traduction in
vitro
Les constructions utilisées pour produire la P0071 de chien complète et partielle en système de transcription-traduction in vitro sont celles décrites dans le chapitre 29 ("Matériel et méthodes").
La synthèse a été réaüsée à l’aide du kit "TNT® T7 Quick coupled transcription/ translation System" (Promega, cat. L1170) en présence de méthionine Le milieu réactioimel pour ime synthèse est de 50 pl.
Matériel et méthodes