MODELO DENV2f COM SUBSTRATO 2 (DENV2f-SUBS2)

Observamos, na simulação anterior do modelo DENV2f com o substrato-1 (ALA- GLY-ARG-LYS-SER-ILE-NME), que era necessário um novo modelo de substrato para o estudo da protease DENV2f.

A sequência de aminoácidos do novo modelo de substrato foi obtida de um artigo experimental que testou várias sequências de aminoácidos de oito resíduos,(SHIRYAEV et al., 2007) mostrando que a sequência que apresentava maior eficiência catalítica para a protease de serina (NS2B-NS3) do vírus da Dengue era GKKRR↓PVR (a seta para baixo indica a região da quebra da ligação entre os resíduos). (SHIRYAEV et al., 2007) . Desta maneira, decidimos estudar a DENV2f com um novo modelo se substrato baseado nesses dados.

Então, escolhemos um segundo modelo para o substrato, aqui referenciado de substrato-2, com os quatro aminoácidos RRVP (CH3NH-R-R-P-V-COCH3), pois evitaria

assim problemas com estrutura desse substrato, onde CH3NH e COCH3 são resíduos para

completar a valência.

Alinhamos os resíduos desse novo substrato na estrutura de raio-X do inibidor que também contém quatro aminoácidos, mantendo a díade R-P próxima a região da serina do sítio ativo (Figura 74). Isso é fundamental para o estudo do mecanismo de reação que será mostrado na próxima secção (Página 133). Desta maneira, fizemos o estudo de dinâmica molecular desse novo sistema (DENV2f-SUBS2).

A Figura 75 mostra o RMSD obtido para a simulação de 125 ns de dinâmica molecular para a estrutura DENV2f-SUBS2. Nos primeiros 5 ns de simulação, onde o substrato (CH3NH-R-R-P-V-COCH3) estava preso por uma restrição com constante de força

de 200 kcal mol-1 Å-2, o seu RMSD (gráfico verde na Figura 75), em relação a estrutura inicial, se mantém numa região com pouca oscilação. Depois de retirada a restrição, o substrato se estabiliza oscilando numa região de 1,8 Å, entretanto, na região de 80-100 ns percebe-se uma maior oscilação, provavelmente devido ao molde usado para o substrato-2, em que os resíduos do inibidor são diferentes, e o alinhamento só se deu pelo backbone da estrutura, portanto, as cadeias laterais acabam se movendo mais para se adaptar as regiões da protease. No entanto, o comportamento da protease de serina (DENVf2 na Figura 75), assim como das regiões NS3 e NS2B é de um RMSD de aproximadamente 2,4 Å, mas são estabilizados depois dos 40 ns de dinâmica molecular.

Figura 74: Uma conformação da DENV2f-SUBS2 retirada da simulação de dinâmica molecular numa

ensemble NPT. As moléculas de água da caixa de simulação não estão representadas na figura para melhor

visualização. Em Azul NS3, vermelho a NS2B, representado em canudo estão os resíduos do sítio ativo (HIS33, ASP57 e SER117), e a representação em bola são do inibidor sem os hidrogênios para a melhor visualização.

Observa-se que existe uma variação menor em torno da média do RMSD quando comparamos com o caso anterior (DENV2f-SUBS1), mostrando que um substrato menor interfere menos na estrutura da proteína.

Figura 75: RMSD para DENV2f (preto), assim como, o RMSD só para a NS3 resíduos 1 a 152 em azul, NS2B

resíduos 153 a 192 em vermelho e para o substrato (2) em verde.

Analisando o gráfico de RMSF (Figura 76), observa-se que a mobilidade dos resíduos é menor do que no sistema DENV2f-SUBS1(Figura 63, Página 115). Exceto o resíduo 153, pois é um resíduo terminal e tem grande mobilidade em todos os sistemas estudados até aqui. Ou seja, o número menor de resíduos no substrato causou uma menor perturbação no sistema, desse modo, fez com que o sistema se ajustasse mais rapidamente que no caso anterior (DENV2f-SUBS1). Ao compararmos com o sistema DENV2f-INIB (Figura 52, Página 104), percebe-se que o sistema DENV2f-SUBS2 (Figura 76) apresenta maior mobilidade dos seus resíduos, indicando que o substrato provocou uma perturbação maior no sistema.

Figura 76: RMSF para os resíduos da DENV2f-SUBS, região delimitada com seta azul são os resíduos da

NS3, a seta em vermelho são os resíduos da NS2B, já a seta em verde delimita os resíduos do substrato. A numeração é para os resíduos que apresentam maior mobilidade.

Na Figura 77 observa-se a superposição de 700 frames de simulação, permitindo analisar de maneira visual a mobilidade da cadeia principal de cada parte da proteína, NS2B e NS3. Quando o substrato-2 está posicionado na região do sítio ativo, a estrutura se mostra com pouca variação da posição dos átomos da cadeia principal para NS3 e NS2B. Não foi o que percebeu-se na secção anterior. Isso indica que esse substrato com quatro aminoácidos é um modelo melhor para o estudo do mecanismo de reação.

Figura 77: Ilustração da superposição para as 750 conformações retiradas da simulação de dinâmica

molecular NPT da DENV2f-SUBS2. a) superposição da NS3; b) superposição da NS2B. A região da NS3 (azul), em vermelho a NS2B.

A Figura 78 mostra um histograma dos resíduos da protease que estão a aproximadamente 5,0 Å do substrato. Dois dos resíduos da tríade catalítica (HIS33 e SER117) aparecem em todos os frames dentro dessa região, e o outro resíduo da tríade (ASP57) aparece em 60 % dos frames. Só um resíduo SER188, da região NS2B aparece em mais de 50 % dos frames. A maior interação do substrato é com resíduos da NS3. As interações por podem ser ligações de hidrogênio, eletrostáticas ou de van der Waals.

Figura 78: Gráfico dos resíduos que estão num raio de 5.0 Å dos resíduos do substrato (2). Os resíduos

vizinhos estão no eixo da abscissa, enquanto a frequência da contagem dos frames que aparecem está no eixo da ordenada.

Observando a Tabela 4, identifica-se quais são os resíduos da protease que mais fazem ligações de hidrogênio com o substrato-2.

Tabela 4: Dados das ligações de hidrogênio entre a DENV2f e o substrato (2). Resíduos do substrato estão

destacados em negrito.

Aceitador Doador % Tempo Média da distância (Å)

GLU153 ARG197 29 2,81

VAL34 ARG197 28 2,82

PRO114 ARG196 11 2,88

Os resíduos da proteína que mais interagem por ligações de hidrogênio com substrato- 2 foram GLU153, VAL34, PRO114 e TYR143. Esses resíduos diferem do caso com o substrato-1 (Tabela 3, Página 124), exceto pelo resíduo TYR143. Sabemos que o resíduo TYR143 pode ser importante para estudo do mecanismo, pois o mesmo é forma uma cavidade oxiânion que estabiliza um dos intermediários da reação.

Para podermos começar o estudo da reação foi necessário avaliar duas distâncias específicas. Uma é definida entre o oxigênio da serina (SER117) e o carbono carboxílico de um dos resíduos do substrato, o que corresponde ao ataque nucleofílico da serina. A outra distância é definida entre o hidrogênio da serina e o nitrogênio épsilon da histidina, ambos resíduos do sítio ativo.

Figura 79: Gráfico de distâncias e ilustração das mesmas na imagem ao lado. A distância d1 é definida

entre o hidrogênio Hγ1 da serina e o nitrogênio Nε2 da histidina, e d2 é a distância entre o oxigênio Oγ1 da serina e o carbono carboxílico Cγ2 do substrato-2.

A média dessas duas distâncias são d1= 2,75 (± 1,18) Å e d2 = 5,65 (± 0,72) Å (Figura 79). Como veremos na seção seguinte, essas distâncias d1 e d2 são de fundamental importância para o estudo do mecanismo de reação catalisado pela protease de serina.

Observa-se que o substrato em alguns frames fica aproximadamente a 3.0 Å da serina (SER117) do sítio ativo (d2). Assim como o hidrogênio da serina está sempre muito próximo ao nitrogênio épsilon da histidina (d1). Para a próxima etapa do trabalho, foi necessário escolhermos uma estrutura boa para começar o estudo da reação de quebra da ligação peptídica entre resíduos do substrato. Escolhemos a estrutura que apresentou menores valores d1(3,0 Å) e d2 (1,9 Å), simultaneamente.