Modelo Experimental de pressão arterial de ratos

Os animais foram anestesiados usando-se uma combinação de cetamina/xilazina (na proporção 90/10 mg/Kg de peso corporal, respectivamente, por via i.p) e submetidos à cirurgia para canulação da artéria carótida e veia femoral, no

intuito de se obter o registro da pressão arterial direta e administração de drogas, respectivamente.

Os animais foram fixados em decúbito dorsal e após, foi feita uma incisão medial na região cervical anterior, seguida de dissecção não cortante, e isolamento das glândulas parótidas direita e esquerda. A incisão foi aprofundada até a traquéia. Após divisão marginal desse órgão foi feita a identificação do feixe vascular nervoso. A seguir a artéria carótida esquerda foi isolada com cuidado para não lesionar o nervo vago. Essa artéria foi clampeada com uma linha de algodão em uma extremidade mais cefálica e com uma pinça tipo bulldog na extremidade mais caudal. No espaço entre os dois clampeamentos, o vaso foi cortado em V para introdução de uma cânula de polietileno (PE-50) preenchida com heparina (100UI/mL) com abertura em bisel na direção contrária ao fluxo sanguíneo. A cânula foi introduzida na referida artéria, para registro da pressão arterial seguida de ligadura em torno do vaso para fixação da cânula em seu interior (NASCIMENTO et al., 2006).

Para administração das drogas utilizou-se uma cânula de polietileno (PE-10) também preenchida com heparina (100 UI/mL) inserida na veia femural. A cânula, no entanto, seguiu um trajeto subcutâneo na região dorsal no sentido caudal-cranial, sendo exposta no dorso superior por pequena incisão na pele.

Os animais foram colocados numa placa aquecida para manter a temperatura corporal normal.

Usamos um método direto para medição aguda da pressão arterial ao conectarmos a cânula implantada na artéria carótida a um transdutor de pressão arterial Gould Stanthan P 23 (Gould Co.Inc., Oxnard, CA, USA), acoplado a um fisiógrafo de dois canais (Gemini 7070 Ugo Basile Varese-Itália) por meio de uma pena inscritora. Antes do início dos registros pressóricos, a artéria carótida canulada foi conectada a um manômetro aneróide, regulado para uma pressão de aproximadamente 100 mmHg para calibração do instrumento (SILVA et al., 2005).

Os animais também foram entubados com cânula endotraqueal para assistência ventilatória, quando necessário. A cânula foi conectada a um respirador mecânico (Ugo Basile 7025) com os seguintes parâmetros: volume corrente de 1ml/100g, freqüência respiratória de 75 ciclos/min e pressão positiva de 2cmH20. Oxigênio também foi fornecido através de um cilindro com fração inspirada de oxigênio (FIO2) entre 21-100%) (RAMOS et al., 2006).

Para os experimentos de pressão arterial, os animais foram divididos em três grupos (n=5) (normotensos, hipertensos induzidos por clampeamento da artéria renal (modelo Goldblatt 2R-1C), após 3 e 4 semanas. O grupo normotenso foi subdividido em três subgrupos; (salina, BPP-Cdc (50µg) e BPP-9a (50µg)). O grupo Goldblatt (2R-1C) após 3 semanas da implantação do clipe, recebeu infusão intravenosa apenas do BPP-Cdc (50µg). O terceiro grupo, modelo Goldblatt (2R-1C), após 4 semanas da implantação do clipe, foi subdividido em dois subgrupos (BPP-Cdc (50µg) e BPP-9a (50µg). A reatividade pressórica desses grupos foi avaliada pela administração endovenosa de bradicinina e angiotensina I, totalizando 30 ratos (Sigma Chemical Company, St Louis, Mo.)

Após um período de estabilização de no mínimo 30 minutos, com registro contínuo da pressão arterial, por meio do implante femoral, fez-se a administração endovenosa em bolus de bradicinina (BK- 250ng) e angiotensina I (ANG I- 10ng), com intervalo de quinze minutos entre as injeções, para avaliação da resposta vasopressora e vasorelaxante. Interessante resaltar, que as injeções endovenosas não ultrapassaram 0,4 ml, evitando-se assim, uma hipervolemia e, por conseguinte, uma hipertensão. Também, tivemos o cuidado de evitar a injeção de ar e esperar a normatização da pressão antes de se injetar a droga seguinte e de lavar a cânula com 0,1 ml de salina, afim de não ficar substância ensaiada na cânula.

O efeito da BK e ANG I foram investigados antes e após o pré-tratamento com BPP-Cdc, BPP-9a e controle com salina.

Por fim, o animal era sacrificado com tiopental sódico (Thiopental Cristália, SP, Brasil) 100mg/kg, i.v, seguido de cloreto de potássio (3M, 3 m;, i.v) após aprofundamento da anestesia.

4.5.1. Modelo Goldblatt (2R-1C)

Para a cirurgia de indução do modelo de hipertensão renal crônica (2R-1C), seguindo o modelo de Goldblatt et al., (1934), o animal foi anestesiado com xilazina (10 mg/ Kg; i.p) e cetamina (90 mg/Kg; i.p), a seguir fixado em posição lateral, onde se realizou uma tricotomia na região póstero-lateral e uma anti-sepsia com iodo. Posteriormente uma pequena incisão no flanco foi realizada e o rim esquerdo foi acessado e cuidadosamente manipulado para clipagem da artéria renal, a qual foi individualizada por um curto segmento por meio de dissecção não cortante. A

estenose da artéria renal esquerda deu-se com a colocação de um clipe de prata de 8 x 2 mm de abertura ajustável. O rim retornou à cavidade retroperitoneal e a incisão na pele foi suturada (BEIERWALTES et al., 1995; DIAS et al., 1999).

Os animais receberam benzil penicilina (100.000 UI/Kg) e cetoprofeno (20mg/Kg) no pós-operatório imediato. Os animais também foram tratados com benzil penicilina (100.000 UI/Kg) após 15 dias da cirurgia e receberam rifamicina sódica diariamente no local da incisão, durante todo o período de cicatrização cirúrgica (DIAS et al., 1999).

Utilizamos um método indireto nas medições da pressão sanguínea arterial sistólica, diastólica e média e da freqüência cardíaca, por meio de pletismógrafo de manguito de cauda (“tail-cuff”) acoplado a um medidor de pressão digital modelo LE 501 (Lettica PanLab, Barcelona, Espanha). A pressão arterial foi determinada diariamente, aquecendo-se previamente o animal (em ambiente entre 40º e 45º C durante 10 minutos (DIAS et al., 1999). Este método foi utilizado por ser amplamente empregado, depender de técnica simples, ser rápido e não necessitar do uso de anestésico (DIAS et al., 1999).

Para validar o método indireto na determinação da pressão arterial, assim como a avaliação da atividade pressórica frente à administração de determinadas drogas, a pressão arterial também foi determinada pelo registro direto em animais com a artéria carótida cateterizada (DANANBERG, SIDER e GREIKIN, 1993).

Os experimentos in vivo com os ratos submetidos ao modelo (Goldblatt 2R-1C) foram executados após três e quatro semanas da colocação do clipe e mantidos em gaiolas individuais, com ração e água ad libitum. Na noite anterior ao estudo, os ratos eram privados de comida, mas com livre acesso à água.