Modelo experimental do ensaio biológico com

Para o ensaio biológico, realizado com o objetivo de testar o potencial hipolipidêmico dos complexos do flavonóide rutina com organoestânicos, foram utilizados coelhos machos da raça Nova Zelândia branco, com 50 dias de idade, pesando em média 1200 g e alimentados com 120 gramas/dia da ração comercial da marca PURINA. Os testes foram executados utilizando 6 animais para cada grupo de substâncias testadas.

Para fins de comparação foram administrados em dois grupos individualmente, em substituição aos complexos sintetizados, o flavonóide Rutina isoladamente e o medicamento líptor cujo principio ativo é a atorvastatina cálcica que já possui grande aplicabilidade na industria farmacêutica na mesma concentração 5 mg.

Para que a indução da hiperlipidemia fosse obtida, foi incorporado a dieta dos animais, exceto para o grupo 1 controle, Colesterol 0,5 % e Ácido Cólico 0,1%.

A Tabela 3 demonstra a disposição dos animais em cada grupo e substâncias administradas

Tabela 3- Disposição dos animais em cada grupo e as substâncias-testes administradas

Grupos Tratamento utilizado

1 2 3 4 5 6 7 8 Ração

Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%)

Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) + Rutina Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) +SN1 Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) + SN2 Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) + SN3 Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) + SN4

Ração + Colesterol (0,5%) + Ácido Cólico (0,1%) + Atorvastatina

As dosagens dos constituintes sanguíneos colesterol-total, triacilgliceróis, colesterol-HDL e colesterol-LDL foram realizadas em três etapas. Inicialmente após 5 dias de adaptação dos animais caracterizando o tempo zero, após 15 dias de tratamento e com 30 dias concluídos sob o tratamento descrito. Os animais encontravam-se em jejum de doze horas e a coleta de sangue foi efetuada pelo plexo venoso retro-orbital utilizando-se capilar.

As amostras de sangue dos animais foram centrifugadas a velocidade de 7100 x g, durante 15 minutos, para a obtenção do soro. As dosagens sorológicas foram efetuadas no equipamento de dosagens multiparamétrico de Bioquímica (Alizé), utilizando kits da marca BioMérieux.

O equipamento foi programado para promover a mistura dos reagentes bem como cada soro apresentado separadamente conferindo assim maior confiabilidade a reação. O equipamento nos forneceu valores diretos das concentrações existentes em cada amostra, fazendo diretamente os cálculos que envolvem a absorção da amostra e branco como a relação estabelecida pela curva padrão elaborada previamente antes do inicio das análises.

A fórmula geral para a conversão da absorvância encontrada em concentração em mg/dL(para todos os constituintes exceto as transaminases que foi estabelecido em U\I e proteína total g\ dL) foi a seguinte:

Aamostra

A

3.3.1.1- Determinação do colesterol-total

A análise colorimétrica do colesterol no soro obtido, baseou-se na transformação do colesterol esterificado e ácidos graxos, mediado pela colesterol esterase. O colesterol formado é oxidado pela enzima colesterol oxidase em colesten-4-ona-3, liberando água oxigenada. A reação do fenol e amino-4-antipirina com a água oxigenada produzida na reação anterior pela ação da peroxidase origina um cromogênio, que possui absorvância em 500 nm, segundo as reações descritas abaixo:

Colesterol esterificado Colesterol + Ácido graxo

colesterol esterase

Colesterol Colesterol-4-ona-3 + H

colesterol oxidase

O

2H

O

+ fenol + amino 4 antipirina cromogênio + 4Hperoxidase

O

Foi colocado no equipamento uma solução tampão fosfato pH 7,00 a 0,1 mol\L, contendo as respectivas enzimas solubilizadas e separadamente os soros sangüíneos a serem analisados.

O equipamento foi programado para efetuar reação colorimétrica promovendo a mistura das soluções mencionadas acima e os determinados soros, que foram incubados a 37°C e analisados em um comprimento de onda de 500 nm. A partir de cálculos prévios o aparelho nos forneceu o valor direto da concentração de colesterol-total presente em cada soro em mg/dL.

3.3.1.2-Determinação do triacilglicerol

A dosagem dos níveis de triacilglicerol séricos foi efetuada por via inteiramente enzimática.

A enzima lipase degrada os triacilgliceróis em glicerol mais ácidos graxos. O glicerol obtido reagiu com o ATP, em presença de glicerolquinase, obtendo glicerol-3-fosfato e ADP. O glicerol-3 fosfato é oxidado a dihidroxiacetonafosfato pelo glicerol-3 fosfato oxidase, liberando água oxigenada. A água oxigenada, juntamente com paraclorofenol e amino-4- antipirina, em presença da peroxidase, transforma-se no cromogênio ( que absorve em 505 nm), liberando água.

As equações foram as seguintes

Triacilglicerol glicerol + Ácidos graxos lipase

Glicerol + APT Glicerol 3 fosfato + ADPglicerolquinase

Glicerol 3 fosfato dihidroxiacetonafosfato + 4 Hglicerol 3 fosfato ₂O₂

oxidase

2 H₂O₂ + paraclofenol + amino-4-antipirina cromogênio + 4 Hperoxidase ₂O

Foi colocado no equipamento uma solução tampão fosfato pH 7,00 a 0,1 mol\L, contendo as respectivas enzimas solubilizadas e separadamente os soros sangüíneos a serem analisados.

O equipamento foi programado para efetuar reação colorimétrica promovendo a mistura das soluções mencionadas acima e os determinados soros, que foram incubados a 37°C e analisados em um comprimento de onda de 505 nm. A partir de cálculos prévios o aparelho nos forneceu o valor direto da concentração de triacilglicerol presente em cada soro em mg/dL.

3.3.1.3-Determinação do colesterol-HDL

O método de dosagem de colesterol-HDL baseia-se na precipitação dos quilomícrons, lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) presentes na amostra. Esta precipitação é obtida a partir da adição de ácido fosfotúngico na presença dos íons magnésio. A dosagem sorológica desta lipoproteína requer um tratamento diferenciado nas amostras dos soros do sangue dos coelhos. Antes que o equipamento Alisé

possa efetuar a leitura do colesterol desta lipoproteína alíquotas de 500 µL de cada soro coletado são separadas e assim promove-se a adição de 1mL do reativo precipitante composto pelo ácido fosfotúngico (40g/L) e MgCl26H2O (100g/L) pH 6,2. Esta nova solução permanece em descanso na geladeira durante 10 minutos entre 2-8°C. Centrifugam-se todas as amostras por 15 mim a 11833 x g. No sobrenadante resultante desta precipitação esta presente a lipoproteína HDL colesterol. A análise é então efetuada pelo mesmo processo já descrito para a determinação de colesterol total.

3.3.1.4- Determinação do colesterol-LDL

As lipoproteínas são diferenciadas de acordo com sua densidade, seu comportamento elétrico e sua reatividade frente aos anticorpos específicos. Dado que as diferenças entre a composição ocasionam necessariamente variações importantes nas interações eletrostáticas e do tipo Van de Walls, tem-se estudado a influencia dos polímeros anfipáticos sobre as lipoproteínas separadas por centrifugação e constatando que algumas lipoproteínas precipitam especificamente com a adição de certos polímeros anfipáticos. O método de dosagem baseia-se na precipitação da lipoproteína colesterol-LDL presente nos soros a serem analisados pela adição do reativo precipitante composto por sufactante aniônico policiclico policondensado (0,8 g/L), sufactante aniônico policiclico (0,4g\L), tampão dioxano substituído (12,4 mmol/L) e tampão imidazol (25mmol/L) pH 6,1. A dosagem sorológica desta lipoproteína requer um tratamento diferenciado nas amostras dos soros do sangue dos coelhos. Antes que o equipamento Alisé possa efetuar a leitura do colesterol desta lipoproteína alíquotas de 50 µL de cada soro coletado são separadas e assim promove-se a adição de 1mL do reativo precipitante. Esta nova solução permanece em descanso na geladeira durante 30 minutos entre 2-8°C. Centrifugam-se todas as amostras por 5 mim a 9466 x g. O precipitado de cada amostra, onde esta presente a lipoproteína colesterol-LDL, é solubilizado com o reativo 2 do kit onde estão presentes citrato trisódico 0,15 mol/L e cloreto de sódio 0,11 mol/L. A análise do colesterol presente nesta

lipoproteína foi determinado pelo mesmo processo já descrito na dosagem de colesterol total.