Modelo experimental: Trabalho 2

4.2.1. Animais e grupos

A pesquisa foi aprovada pelo Comissão de Ética do Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo (CEUA nº 3566241018).

Foram utilizados 32 ratos Wistar machos precedentes do Biotério Central da UNICAMP e foram mantidos na guarda de animais do Laboratório de Fisiologia de Nutrição (UNIFESP) e com 21 dias. Foram mantidos sob condições de ciclo de luz controladas (12 horas claro e 12 horas escuro) e temperatura constante (24 ± 1º C). Tiveram livre acesso à água e ração.

Aos 90 dias de vida, os 32 ratos foram distribuídos em 4 grupos, e dos 90 aos 160 dias de vida os animais receberam dieta conforme descrito abaixo:

(1) Dieta controle

(2) Dieta controle + 462,5 mg de goma xantana / kg de dieta (1/4 da dose total) (3) Dieta controle +925 mg de goma xantana / kg de dieta (1/2 da dose total) (4) Dieta controle + 1850 mg de goma xantana / kg de dieta (dose total)

A dieta utilizada foi a comercial Nuvilab® acrescida ou não com goma xantana e os animais foram mantidos com livre acesso à água e dieta em um tratamento de 10 semanas.

Esquema 2: Modelo experimental do trabalho 2 com total de 10 semanas de tratamento

4.2.2. Preparação da dieta com adição de goma xantana

A ração Nuvilab® foi triturada e adicionado goma xantana (Sigma-Aldrich®) por quilograma de ração. Após a adição da goma a ração foi novamente modelada em pellet.

4.2.3. Doses de goma xantana

Para o cálculo da conversão homem vs animal, foi utilizada a fórmula de conversão por área corporal da FDA 2005 (Guidance for Industry: estimating the maximum safe starting

dose in initial clinical trials for therapeutics in adults healthy volunteers). O cálculo da dose

da goma xantana foi:

(1) Controle: dieta sem adição de goma xantana.

(2) Um quarto de dose: 462,5 mg de goma xantana / kg de dieta para mimetizar pessoa adulta que faz uso da goma xantana como ingrediente em dietas restritivas sem glúten e que também consome produtos industrializados que tem como aditivo alimentar a goma xantana.

(3) Meia dose: 925 mg de goma xantana / kg de dieta para mimetizar pessoa adulta com disfagia orofaríngea de grau leve que faz uso de espessante a base de goma xantana, mas não em todas as preparações.

(4) Dose total: 1850 mg de goma xantana / kg de dieta para mimetizar pessoa adulta com disfagia orofaríngea de grau moderado que faz uso de espessante a base de goma xantana em todos os líquidos e na preparação de refeições.

4.2.4. Eutanásia e coleta de amostras

Após 10 semanas de tratamento com as respectivas dietas, os ratos foram pesados, sedados e eutanasiados com punção cardíaca após jejum de oito horas. Imediatamente após a eutanásia, os tecidos: fígado, tecido muscular gastrocnêmio e tecidos adiposos brancos (epididimal, retroperitoneal, mesentérico), duodeno, ceco e cólon distal; foram dissecados, pesados, colocados em nitrogênio líquido e armazenados à -80ºC para posterior extração de proteína total. O cólon fixado em cortiça para logo em seguida foi emblocado em parafina e posterior corte histológico. O sangue foi coletado em tubos secos e centrifugado a 2500 rpm por 15 minutos a 4º C. O soro foi aliquotado e estocado a -80ºC até a realização das análises bioquímicas/hormonais.

4.2.5. Análise histológica do cólon

Secções do cólon distal foram coletadas imediatamente após a eutanásia e foram fixadas em cortiça e em formalina tamponada 10% por 48 horas e lavadas com etanol a 70% durante 1 hora, seguido por incubação em etanol a 70% durante a noite.

As amostras foram processadas, embebidas em parafina para emblocar e posteriormente montadas em lâminas. Foram confeccionadas lâminas com cortes semi-seriados de 5µm de espessura. Para coloração dos cortes histológicos utilizamos da técnica de hematoxilina e eosina (H&E).

Uma análise qualitativa através da descrição morfológica cumpriu os seguintes critérios: presença de processo inflamatório, células gigantes multicelulares, áreas de fibrose, áreas de necrose, metaplasia, displasia e/ou adenocarcinoma.

Para quantificar o grau de inflamação, o tecido foi classificado por escores, levando-se em consideração a intensidade do processo inflamatório a citar: 1-ausência de processo inflamatório; 2-inflamação leve; 3-inflamação moderada; 4-inflamação intensa (Stanford, 1980).

As imagens foram capturadas utilizando microscópio óptico acoplado ao sistema de captação de imagens.

4.2.6. Análise imuno-histoquímica do cólon com os anticorpos: ZO-1, Claudina 2, Ocludina, TNF-α

Foram avaliadas a imunoexpressão das proteínas citadas em cortes seriados de 3µm posicionados em lâminas silanizadas. No próximo passo, os cortes foram desparafinados em xilol, reidratados em etanol (99,5 %) e pré-tratados com tampão de ácido-cítrico (10 mM, pH 6, 0,1 M ácido cítrico, Synth^®, São Paulo, Brasil; 0,1 M citrato de sódio – Synth^®, São Paulo, Brasil ) em micro-ondas , por três ciclos de cinco minutos cada para recuperação antigênica. Em seguida, os cortes foram incubados overnight, com os anticorpos primários anti-TNFα , anti-Claudina 2, anti-Ocludina e anti-ZO 1 (ThermoFisher Scientitfic®, EUA) respectivamente nas diluições: 1:6; 1:700; 1:200; 1:300 (anticorpo: solução de albumina), a 4 ^oC. No dia seguinte, os espécimes foram submetidos a duas lavagens com tampão fosfato de sódio (PBS) e os cortes foram incubados com o anticorpo secundário por 45 minutos, e em seguida, corados com DAB (3,3-diaminobenzina, 0,05%) (DAKO North America Inc®, Califórnia, EUA) e contra-corados com a hematoxilina de Harris, Sigma®, Missouri, EUA).

Uma vez realizada a marcação, foram avaliados pelo método semi-quantitativo de 0 a 3, utilizando os seguintes critérios: 0 sem coloração detectável; 1 <10% de células coradas; 2 > 10%, mas <50% células coradas; 3 coloração homogênea em> 50% das células segundo metodologia Salim et al. (2008).

4.2.7. Análise estatística

Todos os dados foram submetidos à análise de normalidade e homogeneidade. Para os dados paramétricos, os resultados foram expressos como média ± EPM e foram submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA ONE-WAY) e ao teste post hoc Tukey, O nível de significância adotado foi p≤0,05.

Para os dados não paramétricos, os resultados foram expressos como mediana (valor mínimo – valor máximo) e foram submetidos ao teste de Kruskall-Wallis e ao post hoc

Games-Howell. Os dados na análise histopatológica e imuno-histoquímica foram expressos como média ± DP, por a quantificação e classificação ser escores. O nível de significância adotado foi p≤0,05.

Com o objetivo de realizar uma interpretação da magnitude biológica dos dados e comportamento da variável em estudo, foi realizada análise gráfica descritiva por meio de dot

plot apresentado em mediana interquartil. Foi realizado o cálculo com o coeficiente de variação e tamanho de efeito através do cálculo de g de Hedges.

Foi considerado para o coeficiente de variação: ≤ 15 % baixa dispersão (grupo é homogêneo), 16 a 30% média dispersão e > 30% alta dispersão (grupo é heterogêneo). Para interpretação do tamanho do efeito de Hedges (g de Hedges), tem-se como referência: tamanho de efeito pequeno, médio ou grande; respectivamente, 0,2 a 0,3; 0,4 a 0,7 e ≥ 0,8 (Espírito-Santo e Daniel, 2015) (https://www.statisticshowto.datasciencecentral.com/hedges-g).

Para os cálculos, foi utilizado o programa SPSS Statistic 22. Para os gráficos, foi utilizado o programa Prima 5. Para o cálculo do tamanho de efeito de Hedges, foi utilizado o site https://www.polyu.edu.hk/mm/effectsizefaqs/calculator/calculator.html