Muitos modelos animais de avaliação das atividades antinociceptiva e anti- inflamatória são utilizados para avaliar a eficácia de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias e dolorosas, bem como estudar seus mecanismos de ação e, de medicamentos já utilizados na terapêutica, mas que não têm o mecanismo de ação farmacológica ainda totalmente esclarecido (WALKER et al, 1999).
A dor não pode ser monitorada em animais, porém ela pode ser estimada por avaliação das respostas de animais a estímulos nociceptivos. Os testes nociceptivos incluem os mais variados estímulos seja elétrico, mecânico, químico, térmico (LE BARS et al, 2001). Neste trabalho, utilizou-se modelos aplicando-se estímulo químico, como o teste de contorções abdominais no qual o estímulo nocivo é o ácido acético na concentração de 0,6%; o teste da placa quente no qual o estímulo térmico é o agente nóxico e o teste da formalina em que o formaldeído, agente irritante, é utilizado na concentração de 1%.
O teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético sugerido por Koster e col. (1959), é um modelo de dor visceral ocasionada pela administração i.p. de ácido acético na concentração de 0,6% (LE BARS et al, 2001). Este modelo de dor é muito utilizado para avaliar efeitos antinociceptivos periféricos de natureza anti- inflamatória, uma vez que o ácido acético, na concentração utilizada, induz a dor indireta resultado de uma inflamação aguda no peritônio (IKEDA et al, 2001).
O ácido acético é um agente flogístico que provoca irritação na membrana do peritônio e como consequência desencadeia uma série de movimentos estereotipados como contração da parede abdominal, rotação do corpo e extensão das patas traseiras (LE BARS et al,.2001). Nesse modelo de nocicepção, macrófagos e mastócitos sinalizam a presença de material estranho, liberando citocinas e mediadores inflamatórios clássicos (prostaglandinas, histamina,
serotonina e bradicinina). A hiperalgesia é provocada pela liberação de TNF-α, interleucina 1β (IL-1β) e interleucina 8 (IL-8) por macrófagos e mastócitos residentes na cavidade peritoneal (RIBEIRO et al, 2000). Estas citocinas liberadas pelas células residentes medeiam as contorções, principalmente, através da produção de produtos da ciclooxigenase (prostaglandinas) e mediadores simpatomiméticos, os mediadores finais de hiperalgesia (BRITO et al 2001).
O teste da placa quente é um modelo utilizado para verificar o envolvimento do sistema central no efeito antinociceptivo de drogas. Este teste indica a resposta ao estímulo térmico, o qual é associado à neurotransmissão central (HUNSKAAR et al., 1986). O estimulo nóxico que caracteriza este teste, o calor, é frequentemente utilizado em modelos de dor aguda (ANTONIOLLI; VILLAR, 2003), o qual ativa nociceptores (fibras Aδ e C) fazendo a condução do impulso ao corno dorsal da medula espinhal, e posteriormente aos centros corticais (PIETROVSKI, 2004).
O comportamento estereotípico do animal sobre a placa, “sapatear” ou lamber as patas, são considerados respostas supraespinhais em resposta ao estímulo térmico, e a latência para o aparecimento desta resposta é cronometrada em segundos (LE BARS, 2001). Ankier (1974), avaliando analgésicos análogos à morfina, demonstrou que a placa quente a 55 °C produzia resultados falsos negativos, o que mascarava a atividade de analgésicos menos potentes como ácido acetilsalicílico ou paracetamol e sugeriu o uso de temperaturas inferiores (em torno de 50 oC). Por este motivo neste trabalho utilizamos a placa quente à temperatura de 50 ± 0,5 °C.
O teste da formalina, primeiramente introduzido por Dubuisson e Dennis (1977), é um dos modelos mais bem estabelecidos e empregados experimentalmente para o estudo de mecanismos nociceptivos (CHICHORRO et al, 2004). A injeção intraplantar de formalina (solução de formaldeído a 1%) na pata induz uma resposta dividida em duas fases, uma fase curta que pode ser devido à estimulação química direta dos nociceptores, enquanto a segunda fase é dependente da mecanismos periféricos. Entre uma fase e outra tem o período de quiescência (LE BARS, 2001).
A primeira fase que ocorre nos primeiros 5 min após a injeção de formalina é também chamada de fase neurogênica. Ela ocorre em função da ativação direta de fibras aferentes nociceptivas mielinizadas e não mielinizadas, principalmente, fibras C pelo agente nóxico (ABBOTT et al, 1995). Nesta fase pode haver a participação
de substância P e Bk facilitando a neurotransmissão da dor (VANEGAS e SCHAIBLE, 2004).
A segunda fase (15 a 30 min), é também chamada de fase inflamatória. Esta fase envolve um período de sensibilização durante o qual ocorrem fenômenos inflamatórios, com o envolvimento de mediadores da inflamação como PGs, serotonina, histamina e Bk. A origem central ou periférica da segunda fase tem sido objeto de debate (TJOLSEN et al., 1992). Para alguns, a segunda fase é desencadeada pela ativação neuronal durante a primeira fase (CODERRE et al. 1993). No entanto, esta hipótese parece improvável, visto que o formaldeído provoca atividade bifásica em fibras aferentes (MCCALL et al., 1996; PUIG e SORKIN, 1996), mais ainda porque o bloqueio da primeira fase por substâncias com ações rápidas (por exemplo, lidocaína por via s.c.) não elimina a segunda fase (DALLEL et al., 1995). Assim, a segunda fase não pode ser interpretada como uma consequência da primeira, mas claramente provém de mecanismos periféricos (LE BARS et al, 2001).
A contribuição de Bk, citocinas, aminas simpatomiméticas e metabólitos do AA para uma ou as duas fases da formalina já está bem estabelecido (CHICHORRO et al, 2004). Analgésicos opióides mostram atividade nas duas fases do teste. Em contraste, os AINEs como a indometacina mostram atividade apenas na segunda fase (HUNSKAAR e HOLE, 1987; LE BARS, 2001).
Para avaliar a atividade anti-inflamatória foram utilizados os modelos clássicos de inflamação como eritema de orelha, edema de pata provocado por carragenina (Cg) e/ou dextrana, peritonite induzida por Cg e microscopia intravital.
O teste de eritema em orelha de camundongos induzido por óleo de cróton é um modelo útil para avaliar a atividade anti-inflamatória tópica e é sensível tanto para drogas anti-inflamatórias esteroidais e não-esteroidais (TUBARO et al., 1985). A aplicação tópica do óleo de cróton induz uma resposta inflamatória cutânea, caracterizada por intensa vasodilatação e formação de edema, seguido do aumento da espessura da orelha em consequência do extravasamento celular que atinge o pico máximo na sexta hora. Tubaro e col. (1985) demonstraram que na cinética do processo inflamatório induzido pelo óleo de croton, no pico máximo do edema ocorre intensa infiltração celular, sendo que as principais células que participam neste processo são neutrófilos e macrófagos.
O óleo de cróton pode ser extraído de várias espécies, a principal é Croton
ésteres de forbol que são compostos policíclicos derivados do óleo de cróton, o principal é o TPA (12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato). Esta ação irritante se deve à ativação de proteínas quinases C (PKC) (EL-MEKKAWY et al, 2000), que estão envolvidas com a transdução de sinal e desenvolvimento de processos de muitas células e tecidos, produzindo uma variedade de efeitos biológicos no organismo (GOEL et al, 2007). Entre os efeitos estão o aumento da permeabilidade vascular, com indução da síntese de metabólitos do AA e da expressão da COX-2, IL-1β, TNF-α e da molécula de adesão ICAM-1 (CHI et al, 2003).
O modelo de edema de pata induzido por dextrana é um modelo útil para avaliar o efeito anti-inflamatório de substâncias úteis no tratamento da urticária, edema pulmonar e outros tipos de reações anafiláticas. O edema de pata induzido por este polissacarídeo está relacionado com a desgranulação de mastócitos, e consequentemente leva à liberação de histamina e serotonina, as quais contribuem para aumentar a permeabilidade vascular e o extravasamento de fluido (BASTOS et al, 2001). O liquido extravasado é caracterizado por apresentar poucas proteínas e com ausência de acúmulo de neutrófilos (LO et al, 1982).
A inflamação induzida por Cg no modelo de edema de pata é amplamente utilizada para avaliar novos compostos com atividade anti-inflamatória (CAREY et al, 2010), além de avaliar a contribuição do mediadores envolvidos nas alterações vasculares associadas com inflamação aguda (CRISAFULLI et al, 2006). Este polissacarídeo induz edema caracterizado pela presença de exsudato rico em proteínas e com grande quantidade de neutrófilos e metabólitos do AA (LO et al., 1982), outros mediadores inflamatórios (histamina, 5-HT, cininas) (WILLIS, 1969
apud CARVALHO et al, 1999), além do sistema complemento (DI ROSA et al, 1971).
De acordo com Di Rosa e col. (1971), a inflamação induzida por Cg compreende três etapas. Na primeira etapa (0-90 minutos) ocorre intensa vasodilatação e aumento da permeabilidade com liberação de histamina e 5-HT. Na segunda etapa (90-150 minutos) há liberação de cininas que induzem aumento da permeabilidade do endotélio vascular sanguíneo. E, na última etapa (150-360 minutos), há a liberação de prostaglandinas, período caracterizado por intensa migração de leucócitos, principalmente polimorfonucleares. Todos os mediadores liberados são dependentes do sistema complemento (FERREIRA et al., 2004).
Além disso, Rocha et al (2006) investigaram a contribuição da produção de TNF-α para a resposta inflamatória (edema e migração de neutrófilos) causada pela
injeção intraplantar de carragenina na pata de camundongos e demonstraram que esta citocina pró-inflamatória tem um importante papel na gênese deste processo inflamatório. TNF- α é uma potente citocina pró-inflamatória que possui vários efeitos, incluindo a ativação de células inflamatórias, indução de várias proteínas inflamatórias, citotoxicidade (FELDMANN e SAKLATVALA, 2001; HADDAD, 2002; HOPKINS, 2003), estimula a expressão do gene da oxido nítrico sintase induzida (iNOS) em certos tipos de células, também induz a quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T e a expressão de moléculas de adesão (SHIN et al, 2010).
Outro meio utilizado para avaliar a atividade anti-inflamatória do EAML através da resposta do mesmo à migração de células inflamatórias (neutrófilos) para o local da lesão foi o teste da peritonite induzida por Cg em ratos. Este é um modelo caracterizado por aumento no transporte de solutos entre o plasma e a membrana porosa, além da paralela migração celular que ocorre no peritônio. Essas alterações devem-se à vasodilatação dos capilares na membrana peritoneal e pela abertura dos poros nos microvasos, causados por mediadores celulares e inflamatórios, como neutrófilos e PGE2, respectivamente (PAULINO et al, 2008).
Os polimorfonucleares são as principais células a migrarem para a cavidade peritoneal, na fase inicial da resposta inflamatória, neste modelo experimental (LAWRENCE et al., 2002; HATTORI et al, 2010). Os neutrófilos possuem moléculas de adesão (VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina), as quais são expressas após indução por citocinas, como TNF-α, e estão em abundância para ligação rápida a receptores nas células endoteliais ativadas durante a inflamação (LEE et al 2010). A interação de neutrófilos recrutados no sítio da inflamação com células residentes, mediadores inflamatórios locais e/ou matriz extracelular, pode levar à produção de vários outros mediadores, incluindo citocinas, quimiocinas, enzimas, espécies de oxigênio e nitrogênio e metaloproteases, que podem ampliar a resposta inflamatória (ALVES 2009).
Com o objetivo de comprovar a atividade do EAML sobre a migração de leucócitos, foi realizado o teste de microscopia intravital. Este tem por objetivo avaliar na microcirculação mesentérica, por meio de videomonitoramento in vivo, as interações entre os leucócitos e a parede dos vasos sanguíneos (vênulas) no local da inflamação (GRANGER e KUBES, 1994).
A especificidade molecular dos leucócitos tendo como alvo os locais de inflamação é mediada pelas lectinas de membranas, selectinas, integrinas, e a
superfamília de imunoglobulinas, que devido à correlação destas com os mecanismos de interação e adesividade entre diversas moléculas, leucócitos e células endoteliais, são conhecidas como moléculas de adesão. (SIMON e GREEN, 2005).
O recrutamento de leucócitos polimorfonucleares (PMN) livres para o local da inflamação ou infecção é o passo fundamental para resposta imune inata do organismo. A migração de PMNs para estes locais é visto como um processo de várias etapas com envolvimento sequencial de diferentes moléculas de adesão com PMNs e células endoteliais (CE) de superfície. Este processo é iniciado pela ligação PMN-selectina e rolamento ao longo das CE de superfície, seguido por firme adesão dependente de integrinas, antes do extravasamento de PMNs para o espaço tecidual. Esta cascata de eventos moleculares altamente regulada é ditada por propriedades hemodinâmicas, mecânicas e cinéticas de moléculas de adesão participantes (PAWAR et al, 2008).
Muitas técnicas utilizadas para triagem de atividade antinociceptiva e anti- inflamatória são gerais e independem do composto estudado, como o teste de contorções abdominais. Na maioria das vezes, não se chega ao mecanismo de ação definitivo da substância ou extrato estudado, necessitando de técnicas mais avançadas. Porém, estes testes primários são de grande importância e representam etapas iniciais para caracterização farmacológica de novos compostos capazes de interferir no curso da inflamação (LAPA et al, 2003).
3 JUSTIFICATIVA
As pesquisas voltadas para plantas medicinais que são usadas popularmente para tratar diversos distúrbios, entre os quais a dor e a inflamação, podem comprovar seus usos populares além de levar a descoberta de compostos que possam ter atividade biológica. Além disso, o uso de extratos padronizados e com ação comprovada pode beneficiar a população com menos recursos devido seu baixo custo, contribuiria para a descoberta de novos compostos de interesse terapêutico ou base para a síntese de moléculas com potencial para a indústria farmacêutica e para inserção da espécie como recurso terapêutico oficial.
Neste sentido, os estudos oriundos deste trabalho, seguido de estudos pré- clínicos, poderão levar à obtenção de um fitoterápico.
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar as atividades antinociceptiva e anti-inflamatória do extrato aquoso de
Mikania lindleyana (EAML), bem como identificar os constituintes presentes no
mesmo.
4.2 Delineamento experimental
4.2.1 RELACIONADOS À COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Identifiicar as classes de metabólitos secundários presentes no EAML;
Identificar o principal marcador presente no EAML por Cromatografia em camada delgada (CCD), Cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e por Cromatografia liquida acoplada com espectrometria de massa (CLAE-DAD- EM);
4.2.2 RELACIONADOS À TOXICIDADE
Avaliar a toxicidade aguda e determinar a dose letal mediana (DL50) do EAML em camundongos;
4.2.3 RELACIONADOS À ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
Avaliar a possível atividade antinociceptiva do EAML em modelos experimentais de estímulos químicos (contorção abdominal e formalina) e térmico (placa quente);
4.2.4 RELACIONADOS À ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
Analisar os efeitos anti-inflamatórios do EAML nos modelos: edema de pata induzido por dextrana em ratos, edema de pata induzido pela carragenina (Cg) em ratos, dermatite induzida pelo óleo de cróton em camundongos. Avaliar a atividade do extrato na migração de neutrófilos pelo teste da
peritonite induzida por Cg em ratos, e sobre o rolamento e adesão de leucócios pelo teste de microscopia intravital em camundongos.
5 MATERIAIS E MÉTODOS