Modelos de PPARγ com a h´ elice 12 aberta

Receptores Nucleares com a h´ elice 12 aberta

5.1 Modelos de PPARγ com a h´ elice 12 aberta

O modelo da ratoeira sugere um mecanismo de entrada e sa´ıda do ligante no s´ıtio do LBD. Nesse modelo, a hélice 12 encontra-se estendida em rela¸cão à superf´ıcie do LBD na ausência do ligante, permitindo a entrada deste. Entretanto, não existem estruturas cristalográficas de PPARγ com a H12 adotando tal conforma¸cão. Desse forma, para verificar o comportamento da curva de anisotropia em fun¸cão do tempo para essa configura¸cão constru´ımos um modelo para apo-PPARγ com a hélice 12 em uma conforma¸cão aberta, como proposto pelo modelo da ratoeira. Esse modelo foi constru´ıdo a partir da estrutura de holo-PPARγ (PDB: 2PRG) e utilizando simula¸cões de SMD (Steered Molecular Dynamics).

5.1.1 Steered Molecular Dynamics

Importantes eventos biológicos, como a associa¸cão e dissocia¸cão de ligantes envolvem a transi¸cão de um estado de equil´ıbrio para outro. Entretanto eventos que envolvem o cruza- mento de grandes barreiras de potencial ainda são dif´ıceis de serem reproduzidos em simula¸cões convencionais de dinâmica molecular, uma vez que envolvem escalas de tempo muito longas. Dessa forma, o uso de for¸cas externas pode ser utilizado para guiar o sistema de sistema de equil´ıbrio para outro, acelerando o processo de transi¸cão. Nesse contexto, simula¸cão de SMD são uma importante ferramenta no estudo de eventos que envolvem transi¸cões.

78 5 Receptores Nucleares com a h´elice 12 aberta t0 t1 t2 t₃ t4 vt1 vt₂ vt3 vt₄ (a) (b)

Figura 5.1 – (a) SMD com velocidade constante em uma dimens˜ao. Em vermelho est´a representado

o átomo virtual e em azul o átomo SMD. A medida que o átomo virtual se move com velocidade constante, o átomo SMD experimenta uma for¸ca que depende linearmente da separa¸cão entre os dois átomos. (b) Sobreposi¸cão da conforma¸cão adotada pela H12 no inicio (vermelho) e no final (azul) da simula¸cão de SMD.

átomos, chamados de átomos SMD e manter fixos outro conjunto de átomos para estudar o comportamento da prote´ına em diferentes condi¸cões. Neste trabalho foram realizadas simula¸cões de SMD com velocidade constante. Nesse tipo de simula¸cão, aos átomos SMD é aplicada uma for¸ca que corresponde ao deslocamento de uma mola no espa¸co na dire¸cão de- sejada, com velocidade constante (figura 5.1(a) ). A for¸ca externa que atua sobre os átomos SMD á dada por:

F = k [~vt − (~r − ~r0) · ~n] (5.1.1)

onde k é a constante de mola, v a velocidade com que os átomos são puxados, ~r a posi¸cão dos átomos SMD no instante t, ~r0 a posi¸cão inicial dos átomos SMD e ~n a dire¸cão da for¸ca

aplicada (49).

Para construir o modelo de PPARγ com a hélice 12 aberta, os átomos da hélice 12 foram selecionado como átomos SMD e foram puxados para fora, no sentido de formar uma conforma¸cão com a hélice 12 aberta (figura 5.1(b)). Duas simula¸cões de SMD foram realizadas utilizando diferentes dire¸cões para a for¸ca. Cada simula¸cão foi realizada durante 10 ns, utilizando a velocidade de puxamento igual a 3 ˚A/ns e com uma constante de mola igual a 4 kcal mol−1_˚_A−1_.

5.1 Modelos de PPARγ com a h´elice 12 aberta 79

(a) (b)

Figura 5.2 – Estruturas para apo-PPARγ com a H12 aberta obtidas a partir de simula¸c˜oes de SMD.

aberta (5.2). A molécula de cys-fluor foi então acoplada às estruturas finais. O complexo foi submetido a uma simula¸cão em vácuo e a alta temperatura para gerar diferentes configura¸cões iniciais para as simula¸cões de cálculo da fun¸cão de correla¸cão, assim como descrito na se¸cão anterior. Das simula¸cões a temperatura elevada foram obtidas 10 configura¸cões iniciais que passaram pelo mesmo procedimento descrito na se¸cão 4.3.2.1.

5.1.2 Anisotropia de fluorescˆencia para o apo-PPARγ com a H12

aberta

A partir das estruturas geradas por SMD calculamos as curvas de anisotropia para as 10 configura¸cões iniciais constru´ıdas. Na figura5.3estão mostradas as 10 curvas obtidas (laranja). Assim como para as simula¸cões de PPARγ nativo, nota-se um comportamento diversificado para a dinâmica reorientacional do cys-fluor nesse modelo. Entretanto, de forma geral, são observadas curvas com decaimentos mais rápido que os obtidos nas simula¸cões anteriores e, principalmente, que os experimentais.

O objetivo dessas simula¸cões foi mostrar que uma estrutura para apo-PPARγ como proposto pelo modelo da ratoeira, ou seja, com a H12 desprendida da superf´ıcie do LBD, não é capaz de reproduzir os resultados experimentais. Dessa forma, nossos resultados sugerem que mesmo na ausência de ligantes, a hélice 12 deve interagir com a superf´ıcie do dom´ınio. Esses resultados não contradizem o fato de que para apo receptores a H12 é mais móvel que para

80 5 Receptores Nucleares com a h´elice 12 aberta

holo receptores, porém indicam que a varia¸cão conformacional da hélice 12 deve ocorrer em torno em de uma estrutura onde a hélice permanece interagindo com a superf´ıcie do LBD. Se existentes, estruturas que apresentam a H12 aberta devem ser fracamente populadas e não devem apresentar nenhuma fun¸cão no associa¸cão ou dissocia¸cão de ligantes ou no recrutamento de correguladores.

0

1 _Tempo(ns)2

3

4

5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 r(t

)

Experimental Holo-PPAR Experimental Apo-PPAR Holo-PPAR Apo-PPAR

Figura 5.3 – Compara¸c˜ao entre as curvas de anisotropia para o PPARγ: em cinza est˜ao representa-

das as 35 curvas obtidas para o holo-PPARγ nativo, em laranja as 10 curvas para os modelos de apo-PPARγ com a H12 aberta; em azul e vermelho as curvas experimentais para o PPARγ na presen¸ca e na ausˆencia de ligante, respectivamente.

Na figura 5.3 é observada a existência de uma curva de anisotropia para o modelo de PPARγ com a hélice 12 aberta com um decaimento mais lento que as demais curvas obtidas para esse modelo. Ao observar o comportamento da sonda nota-se que esta se encontra durante toda simula¸cão dobrada sobre a hélice 12, como mostrado na figura 5.4(a), sofrendo apenas pequenas altera¸cões conformacionais em torno dessa estrutura e justificando o decaimento observado. Em geral, para as demais simula¸cões, o cys-fluor percorre diferentes conforma¸cões em torno da H12, resultando em curvas de anisotropia com decaimentos rápidos (figura 5.4(b)). Essa curva com decaimento mais lento poderia sugerir que com uma maior amostragem, ou seja, um número maior de simula¸cões, seria possivel observar outras configura¸cões que apresentem decaimentos similares, entretanto, ao avaliar a posi¸cão adotada pela sonda durante a simula¸cão, ve-se que esse é um caso extremo, onde a sonda possui uma dinâmica reorientacional bastante limitada. Dessa forma, mesmo com um número maior de simula¸cões não devem ser obtidas curvas com decaimentos mais lentos e, principalmente, não

5.1 Modelos de PPARγ com a h´elice 12 aberta 81

(a) (b)

Figura 5.4 – Sobreposi¸cão de algumas conforma¸cões adotadas pela molécula de cys-fluor na si- mula¸cão correspondente a curva de anisotropia com o decaimento mais lento (a) e com decaimento mais rápido (b) para o modelo de PPARγ com a H12 aberta.

devem ser obtidas curvas com decaimentos que justifiquem as observa¸cões experimentais. Embora o cys-fluor adote uma conforma¸cão mais r´ıgida, conferindo um tempo de decaimento maior para a curva de anisotropia dessa simula¸cão, a hélice 12 apresenta um comportamento bastante similar ao observado para as demais simula¸cões para esse modelo. Ao comparar a evolu¸cão temporal do RMSD para essa simula¸cão (Simula¸cão 1 da figura 5.5) e para outra associada a uma curva de anisotropia com decaimento mais rápido (Simula¸cão 2 da figura 5.5), observa-se que ambas apresentam desvios significativos em rela¸cão a estrutura inicial, mostrando que a hélice 12 é bastante móvel nos dois casos. Portanto, não é a mobilidade da H12 que afeta o decaimento da anisotropia, mas principalmente a capacidade da sonda de interagir com a prote´ına. O decaimento mais rápido experimental em apo-PPAR não pode, portanto, ser diretamente interpretado como um reflexo da maior mobilidade da H12.

Tempo )s) RM S D (Å )

Figura 5.5 – Evolu¸cão temporal do RMSD da hélice 12 para as simula¸cões com decaimento mais

82 5 Receptores Nucleares com a h´elice 12 aberta

5.2 Outros modelos de receptores nucleares com h´elice

No documento Mobilidade da hélice 12 de receptores nucleares: comparação entre simulações de dinâmica... (páginas 79-84)