Modelos PLS para as Propriedades da Brachiaria

Nos modelos construídos, cada amostra corresponde à média dos espectros medidos para as três replicatas preparadas. Para a construção dos modelos, o conjunto de dados obtidos com os dois instrumentos foi subdividido em 95 amostras de calibração e 40 amostras de validação através do algoritmo de Kennard- Stone. Além da transformação por primeira derivada, os dados foram centrados na média antes da construção de todos os modelos apresentados.

As curvas dos valores estimados versus os valores de referência para cada uma das propriedades modeladas podem ser encontradas no Apêndice A. Os principais parâmetros estatísticos dos modelos construídos com o instrumento de

bancada são mostrados na Tabela 3. Os resultados indicaram que foram obtidos bom ajuste e boa capacidade de previsão com erros relativos variando entre 1,9% (para FDN) e 10% (para a LG). Na Tabela 4, encontram-se os resultados para o espectrofotômetro portátil. Para esse instrumento, os erros relativos de previsão foram ligeiramente superiores, variando entre 2,2% (para FDN) e 11% (para PB).

Tabela 3. Parâmetros estatísticos dos modelos obtidos para as propriedades da Brachiaria utilizando os dados NIR obtidos com o instrumento de bancada.

Parâmetro DIVMS (7 fatores) FB (9 fatores) FDN (8 fatores)

RMSE** R2 Bias** RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias

C* 2,0 0,964 0,0 1,4 0,877 0,0 1,5 0,949 0,0

CV* 2,5 0,947 0,0 1,9 0,790 0,0 1,9 0,920 0,0

P* 2,3 0,946 -0,1 1,5 0,745 0,1 1,4 0,942 -0,2

Parâmetro FDA (9 fatores) Lignina (9 fatores) PB (7 fatores)

RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias

C 1,0 0,963 0,0 0,39 0,944 0,00 0,49 0,983 0,00

CV 1,3 0,937 0,0 0,51 0,906 0,00 0,62 0,973 0,00

P 1,4 0,885 -0,2 0,53 0,827 0,08 0,52 0,988 -0,05

* C = Calibração, CV = Validação cruzada, P = Validação externa

** Valores de RMSE (erro quadrático médio) e bias estão expressos em % de matéria seca para todas as propriedades.

Tabela 4. Parâmetros estatísticos dos modelos obtidos as propriedades da Brachiaria utilizando os dados NIR obtidos com o instrumento portátil.

Parâmetro DIVMS (7 fatores) FB (8 fatores) FDN (8 fatores)

RMSE** R2 Bias** RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias

C* 2,5 0,948 0,0 1,4 0,869 0,0 1,7 0,939 0,0

CV* 3,0 0,927 0,0 1,7 0,813 0,0 2,1 0,907 0,0

P* 2,7 0,910 0,0 1,6 0,805 0,1 1,6 0,910 0,4

Parâmetro FDA (9 fatores) Lignina (8 fatores) PB (8 fatores)

RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias RMSE R2 Bias

C 1,4 0,933 0,0 0,48 0,915 0,00 0,66 0,967 0,00

CV 1,7 0,899 0,0 0,60 0,865 0,00 0,83 0,953 0,00

P 1,7 0,879 0,1 0,52 0,770 0,05 0,76 0,965 0,03

* As abreviações e unidades são as mesmas que foram apresentadas na tabela anterior.

As previsões obtidas para todos os modelos indicaram que a determinação das propriedades de qualidade da Brachiaria por NIRS estão em concordância com as

medidas realizadas pelos métodos de referência utilizando o teste t pareado no nível de 95% de confiança. Para a comparação das exatidões dos modelos obtidos com os dois instrumentos, foram aplicados o teste F e o teste t aleatorizado. Foram utilizadas duas estratégias de comparação: i) a primeira estratégia consistiu em comparar os erros de previsão para as amostras pertencentes aos dois conjuntos de validação externa (intersecção dos conjuntos); e ii) a segunda estratégia consistiu em comparar os erros de previsão de validação cruzada obtidos para os modelos construídos com todas as amostras.

A Tabela 5 mostra os valores p para os dois testes estatísticos utilizados. Como pode ser observado, as duas estratégias de comparação produziram resultados divergentes. No primeiro caso, utilizando as amostras de validação externa, foi observado que apenas os resultados para PB diferiram entre os dois instrumentos no nível de 5% de significância. Para o segundo caso, no qual foram utilizadas praticamente todas as amostras (exceto aquelas identificadas como outliers), todos os modelos à exceção daqueles para FB apresentaram diferenças no nível de 5% significância. Considerando que os dois espectrofotômetros possuem características instrumentais bastante diferentes (faixa espectral de trabalho, resolução espectral e razão sinal/ruído), seria esperado que fossem observadas diferenças entre as exatidões dos modelos construídos. Dessa forma, a utilização de um número maior de amostras para a comparação dos modelos é justificável e aproxima-se mais do propósito de comparação das performances preditivas dos modelos.

Foram observadas diferenças mais significativas entre os modelos obtidos para PB, DIVMS e FDA, conforme pode ser notado com a segunda estratégia de comparação. Os coeficientes de regressão obtidos para os dois instrumentos indicaram que, na maioria dos casos, a região das bandas de combinação entre 4000 e 5000 cm-1 apresentaram contribuições importantes para os modelos do instrumento de bancada. Dessa forma, as diferenças entre as sensibilidades dos instrumentos podem ser, em princípio, relacionadas com as diferenças observadas entre os erros de previsão. Considerando essas diferenças entre faixas espectrais de trabalho, os modelos para PB, DIVMS e FDA (para os quais foram observadas as diferenças mais significativas) foram reconstruídos para o instrumento de bancada utilizando a faixa espectral coincidente com aquela do instrumento portátil. A Tabela 6 mostra os resultados dos testes estatísticos nessa nova situação.

A comparação dos resultados das Tabelas 5 e 6 indica que as diferenças entre as faixas espectrais dos instrumentos podem justificar parcialmente as diferenças entre as exatidões dos modelos. Outras características do instrumento portátil, como menor relação sinal/ruído e resolução espectral, também fornecem contribuições para as diferenças de performance analítica observadas comparativamente ao instrumento de bancada. Essa conclusão é suportada pelo fato de as diferenças entre os RMSEs terem diminuído quando foram utilizadas faixas espectrais coincidentes para os dois instrumentos.

Tabela 5. Valores p obtidos pelo teste t de aleatorizado e pelo teste F para a comparação dos modelos obtidos com os dois espectrofotômetros NIR.

Propriedade

Amostras de intersecção em validação externa

Todas as amostras em validação cruzada n Teste F Teste t aleatorizado n Teste F Teste t aleatorizado FDA 18 0,14 0,15 128 0,0025 8,0×10-5 FDN 15 0,30 0,66 128 0,027 0,015 DIVMS 18 0,40 0,66 132 0,016 0,0026 PB 23 0,0081 0,011 132 3,0×10-5 7,0×10-5 FB 19 0,34 0,42 128 0,31 0,45 LG 16 0,45 0,78 132 0,060 0,038

Tabela 6. Valores p obtidos pelo teste t aleatorizado e pelo teste F para a comparação dos modelos obtidos utilizando faixas espectrais coincidentes.

Propriedade n Teste F Teste t aleatorizado

FDA 128 0,024 0,0078

DIVMS 132 0,023 0,0031

PB 132 0,021 0,0053

Na Tabela 7 encontra-se um resumo das principais figuras de mérito obtidas com os modelos construídos para os dois instrumentos. Para o cálculo da sensibilidade analítica (𝛾), o ruído instrumental (𝜎g, na Equação 20) foi estimado por

meio dos resíduos obtidos da análise componentes principais, conforme recomendação presente na literatura61. A maior diferença entre os valores dessa figura de mérito foi observada entre os modelos para PB. Nesse caso, a sensibilidade

analítica obtida com o instrumento portátil foi cerca de 3 vezes menor que a obtida com o instrumento de bancada.

Tabela 7. Principais figuras de mérito analíticas obtidas como os modelos construídos para os dois instrumentos.

Propriedade Instrumento SEN (×10-5) 𝛾 LOD* LOQ* RMSEP* REP** (%)

DIVMS Portátil 3,2 8,2 4,0 - 5,6 12 - 17 2,7 5,4 Bancada 12 10 3,2 - 4,8 9,6 - 14 2,3 4,7 FDN Portátil 4,6 8,6 6,4 - 6,9 19 - 21 1,6 2,2 Bancada 14 12 5,8 - 6,3 17 - 19 1,4 1,9 FDA Portátil 3,7 7,7 4,2 - 5,1 13 - 15 1,7 4,1 Bancada 10 8,1 2,8 - 3,4 8,5 - 10 1,4 3,3 FB Portátil 4,7 7,0 4,7 - 5,3 14 - 16 1,6 5,2 Bancada 11 8,1 3,9 - 4,6 12 - 14 1,5 4,8 PB Portátil 6,3 13 0,6 - 1,5 1,8 - 4,4 0,76 11 Bancada 38 37 0,39 - 0,86 1,2 - 2,6 0,52 6,8 LG Portátil 12 37 0,62 - 1,0 1,9 - 3,0 0,52 11 Bancada 33 34 0,49 - 0,82 1,5 - 2,5 0,53 10

* LOD, LOQ e RMSEP estão expressos em % de matéria seca; **REP = (RMSEP/média) × 100

Embora tenha sido observada diferenças estatísticas significativas entre alguns modelos, as diferenças entre os erros de previsão e as demais figuras de mérito mostradas na tabela acima são pequenas e não são suficientes para indicar que o instrumento de bancada proporciona resultados superiores aos obtidos com o instrumento portátil sob o ponto de vista prático. Dessa forma, o uso do instrumento portátil mostra-se com uma alternativa viável para realizar a análise de qualidade de forragem uma vez que esse instrumento é mais barato e pode ser utilizado para medidas diretamente no campo.

3.1.3.1 Validação Qualitativa dos Modelos

Para a validação qualitativa dos modelos foram utilizados os coeficientes de regressão com a aplicação do teste de incerteza de Martens. Os gráficos dos coeficientes de regressão para cada propriedade da Brachiaria bem como o espectro pré-processado médio indicando as regiões com as variáveis significativas podem ser

observados no Figura 9. São apresentados apenas os coeficientes de regressão dos modelos construídos para o instrumento de bancada uma vez que os resultados do instrumento portátil são semelhantes e diferem apenas na faixa espectral de trabalho. Conforme mostrado anteriormente, os modelos para PB corresponderam ao caso de maior diferença em sensibilidade analítica. Isso pode ser diretamente relacionado ao que foi observado no gráfico dos coeficientes de regressão. A região das bandas de combinação entre 4000 e 5000 cm-1 foram significativas do ponto de vista estatístico e forneceram contribuição importante para o modelo de regressão. Uma vez que o instrumento portátil não permitiu medidas nessa região e as variáveis acima de 7200 cm-1 _{não contribuíram significativamente para modelar o conteúdo de} PB, a sensibilidade para esse instrumento foi comprometida. As variáveis mais importantes para os modelos de PB foram associadas a regiões onde ocorrem absorção de ligações químicas presentes em proteínas: o intervalo de 4613 a 4587 cm−1 pode ser associado à região de bandas de combinação de estiramento C=O, deformação de N–H no plano e estiramento C–N; a região de 4878 a 4854 cm−1 está associada a bandas de combinação de estiramento N–H; em 5025 cm-1 aparece a banda de combinação de estiramento C–N e deformação no plano de N–H; e em 6900 cm-1 aparece o segundo sobretom de estiramento O-H.

Os coeficientes de regressão para os modelos de FB, FDN e FDA apresentaram coeficientes de regressão significativos basicamente nas mesmas regiões espectrais. Isso acontece porque essas propriedades representam parâmetros relacionados com os mesmos componentes químicos da Brachiaria (celulose e lignina). Bandas importantes para os modelos compreenderam as regiões espectrais por volta de 4405 cm−1 (banda de combinação de O–H/C–H presente na celulose), 4785 e 6711 cm-1 (banda de combinação de O–H polimérico e segundo sobretom de O–H), 5935 cm-1 (segundo sobretom de C–H, banda de combinação de C–H aromático), 8547 cm-1 (terceiro sobretom de C–H e estiramento HC=CH lignina), 6897 cm−1 (segundo sobretom de O–H e combinações de O–H polimérico).

O modelo para LG também apresentou coeficientes de regressão significativos nas regiões onde aparecem as absorções referentes às ligações químicas presentes nesse composto. Alguns exemplos incluem as absorções em 4545 cm−1 _{(combinação C–H/C=O), em 5935 cm}-1 _{(segundo sobretom de C–H, ArC–} H:C–H aromático), e em 8547 cm-1 _{(terceiro sobretom de C–H e HC=CH lignina).}

Os coeficientes de regressão para DIVMS mostraram bandas significativas nas mesmas regiões que às observadas para os modelos de FB, FDN e FDA, porém a relação entre a propriedade e as variáveis espectrais foi a inversa. Isso era esperado uma vez que a digestibilidade de uma forragem será tanto maior quanto menor for o conteúdo de fibras presente.

PB PB

FB FB

Figura 9. Coeficientes de regressão significativos no nível de 95% de confiança de acordo com o teste de incerteza de Martens e espectros médios transformados por derivada primeira com destaque para as regiões espectrais com coeficientes de regressão significativos. Em vermelho, estão representadas regiões cujos os coeficientes de regressão são negativos; em azul, as regiões com coeficientes de regressão positivos; e em preto, as regiões com coeficientes de regressão não-significativos.

FDA FDA

DIVMS DIVMS

3.2 Determinação de Micro- e Macronutrientes em Amostras de Brachiaria por