1 INTRODUÇÃO
5.5 A MODULAÇÃO DO PERFIL M1 POR TAT ENVOLVE O EIXO PERK DA
mal-dobramento destas, o eixo PERK é deflagrado visando atenuar a tradução. Uma vez demonstrado no presente estudo e corroborado pela literatura científica que TAT leva as células microgliais a exibirem um perfil de ativação clássico, buscou-se investigar a potencial modulação do eixo PERK da via UPR na ativação microglial observada. Para isto, empregou- se o uso de o inibidor farmacológico de PERK GSK2606414, que dirige-se ao sítio ligante de ATP da proteína e é considerado um potente inibidor (MAHAMEED et al., 2019). Foi construída uma curva de concentração em 48h com valores utilizados em literatura (0,125 – 0,5 µM) para determinar uma concentração não citotóxica (JIANG et al., 2017). A avaliação da morte celular nas concentrações de inibidor utilizadas foi realizada por ensaio MTT e citometria de fluxo utilizando os marcadores Anexina V/7-AAD. Anexina V liga-se a fosfatidilserina, um fosfolipídeo de membrana que em fases iniciais de apoptose é externalizado na membrana, e 7- AAD é um intercalante de DNA, portanto, só há marcação se houver permeabilidade na célula, o que indica fases finais de apoptose. O ensaio MTT baseia-se na conversão de sais de tetrazólio em cristais de formazan, refletindo a atividade mitocondrial das células. Os resultados estão mostrados na Figura 9. Pode-se observar que a concentração de 0,125 µM foi a que levou a maior viabilidade nas 48h sob tratamento com o inibidor farmacológico, confirmado por ambas as técnicas utilizadas e em literatura (JIANG et al., 2017; MAHAMEED et al., 2019). Portanto, padronizou-se essa concentração para os próximos experimentos.
Figura 9. Perfil de viabilidade de células BV-2 após tratamento com o inibidor farmacológico do eixo PERK da
via UPR. Células BV-2 (0,5x106) foram tratadas com concentrações crescentes de GSK2606414 (PERK
i) por 48
h e a viabilidade celular em cada situação experimental avaliada por ensaio MTT e intensidade de fluorescência dos marcadores Anexina V/7-AAD por citometria de fluxo. Resultados representativos de três experimentos independentes e expressos como médias de porcentagens em relação ao controle celular sem tratamento ± desvio- padrão.
A expressão de genes relacionados envolvidos no eixo PERK foi avaliada por meio de RT-qPCR em células microgliais em 48h sob estímulo da proteína TAT recombinante com adição do inibidor do braço PERK estando os resultados dispostos na Figura 10. Observa-se que a concentração utilizada de GSK2606414 foi suficiente para inibir a expressão das moléculas BiP, ATF4, CHOP, GADD34 e XBP, envolvidas na cascata de sinalização deflagrada pela ativação de PERK, ao passo que TAT foi capaz de sobrexpressá-las. Na adição do inibidor sob estímulo de TAT houve supressão das moléculas, portanto, pode-se inferir que TAT modula o eixo PERK da via UPR em células microgliais. Em linfócitos T, TAT modula a via UPR e contribui para levar às células a apoptose, ativando os três eixos de maneira tempo- dependente (CAMPESTRINI; SILVEIRA; PINTO, 2018). A modulação da via UPR pela proteína TAT do HIV-1 também foi reportada em astrócitos, onde observou-se altos níveis de BiP, XBP-1 e eIF2α e em tecido cerebral in vivo de pacientes apresentando HAND (FAN; HE, 2016). Outro estudo relata a participação do eixo PERK em células endoteliais cerebrais quando estimuladas com TAT na apoptose celular (MA et al., 2016).
Figura 10. Efeito na expressão de componentes do inibidor do eixo PERK da via UPR induzida por TAT em
células BV-2. Células BV-2 (0,5x106) foram tratadas com TAT (400 nM) na presença ou ausência do inibidor
químico de PERK (PERKI, GSK2606414, 0,125 µM). Os níveis de expressão gênica de moléculas relacionadas à
via UPR foram analisados após 48h por RT-qPCR. Resultados representativos de três experimentos independentes e considerados estatisticamente relevantes em relação ao grupo celular tratado com TAT (p < 0.05*, p < 0.01**). A próxima etapa teve como objetivo por fim caracterizar a ativação microglial observada no presente trabalho em paralelo à atividade do eixo PERK da via UPR. Células BV- 2 foram estimuladas com TAT e todos os marcadores encontrados no presente trabalho até aqui foram submetidos a avaliação quando na presença do inibidor de PERK em 48h. Resultados estão dispostos na Figura 11. As citocinas TNF-α, IL-6 e NO tiveram sua secreção significativamente reduzida na presença de TAT com inibidor (Figura 11, a). Consoante com os níveis detectados da chaperona BiP na Figura 10, pode-se inferir que pela produção de diversas proteínas durante a ativação microglial induzida por TAT, a micróglia é responsiva à alta demanda de enovelamento proteico.
A participação da via UPR na ativação microglial clássica também pode ser salientada pela expressão de iNOs, que também foi suprimida quando PERK é inibido na presença de TAT (Figura 10, b). O estudo de Guo e colaboradores (2010) demonstra que XBP1 em sua forma processada (XBP1s) se liga ao promotor do gene iNOs in vivo e in vitro, aumentando sua expressão. Neste estudo, TAT levou à expressão de iNOs (Figura 7), e paralelamente, à expressão de XBP1 em sua forma processada e não-processada (Figura 10). Enfim, a expressão
do marcador CD16/32 também foi diminuída na presença do inibidor de PERK (Figura 11, c), demonstrada pela diminuição da quantidade de eventos positivos na população de células estimuladas com TAT e tratadas com GSK2606414. Assim, os resultados encontrados permitem levar a conclusão de que TAT modula o eixo PERK da via UPR durante a ativação microglial pró-inflamatória observada.
Figura 11. Efeito do inibidor do braço PERK da via UPR sobre a ativação induzida por TAT em células BV-2. a.
Células BV-2 (0,5x106) foram tratadas com TAT (400 nM) na presença ou ausência do inibidor químico de PERK
(PERKI, GSK2606414, 0,125 µM) por 48h e sobrenadantes submetido à análise da expressão das citocinas TNF-
α e IL-6 por CBA e liberação de NO pelo método de Griess. b. Análise da expressão relativa de iNOs por RT- qPCR em células BV-2. Resultados considerados estatisticamente relevantes em relação ao controle tratado com TATHI (p < 0.05*, p < 0.01**).c. Células nas condições experimentais descritas foram marcadas com anticorpos
anti-CD16/32 conjugados à FITC e analisadas por citometria de fluxo. Os números dos quadrantes denotam a porcentagem dos eventos. Os histogramas sobrepostos representam a intensidade de fluorescência de células BV- 2 após marcação. Contr: células não tratadas. Resultados representativos de três experimentos independentes. Resultados expressos como média mais desvio-padrão e considerados estatisticamente relevantes em relação ao controle sem tratamento (p < 0.05*, p < 0.01**).
6 SUMÁRIO DE RESULTADOS
a) TAT recombinante foi expressa e purificada livre de endotoxinas, com sua identidade confirmada por ensaio imunocromatográfico e espectrometria de massas;
b) TAT induziu a expressão de TNF-α, IL-6, MCP-1 e NO de maneira tempo- dependente pós estímulo nas células microgliais;
c) TAT induziu a expressão de iNOS de maneira tempo-dependente pós-estímulo nas células microgliais
d) TAT induziu a expressão de CD16/32 em 48 horas pós-estímulo;
e) A expressão das moléculas BiP, CHOP, XBP-1, GADD34, e ATF4 pertencentes ao eixo PERK da via UPR foram suprimidas quando este foi inibido nas células estimuladas com TAT;
f) A expressão de TNF-α, IL-6, MCP-1 e NO, iNOs e CD16/32 foi suprimida quando o eixo PERK da via UPR foi inibido em células estimuladas com TAT;
7 CONCLUSÃO
Este trabalho empregou uma estratégia de expressão e purificação de TAT recombinante eficiente para o cumprimento do principal objetivo. TAT recombinante induziu a expressão de TNF-α, IL-6, MCP-1 e NO de maneira tempo-dependente, além de iNOs e CD16/32, que são moléculas características de um estado pró-inflamatório clássico microglial, denominado M1. Paralelamente, foi demonstrado que TAT interage com a via UPR aumentando a expressão de moléculas envolvidas no eixo PERK de sinalização, sendo que quando este foi inibido, sob estímulo de TAT, a expressão das moléculas da ativação microglial avaliadas foi suprimida. Assim, a inibição de um braço de uma via celular importante na infecção pelo HIV por um fator viral circulante pode representar um potencial alvo terapêutico, tendo em vista a neuroinflamação e suas injúrias provocadas no ambiente neuronal amplamente relatadas, ainda que haja poucos estudos investigando a importância biológica do estresse no RE nas HAND.
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