Modulação química e epigenética

2.3.2.2.1.1 Seleção do meio de cultivo fermentativo

Antes da realização dos experimentos de modulação química e epigenética foi inicialmente selecionado o meio de cultivo fermentativo que seria utilizado. A produção de metabólitos secundários pelo fungo A. tenuissima SS77 foi avaliada em meio Czapek, de extrato de malte 0,7% e PDB. Os parâmetros utilizados nessa seleção foram o perfil metabólico e o potencial citotóxico dos extratos frente às linhagens de células tumorais.

28 Capítulo I – Material e métodos

2.3.2.2.1.2 Determinação da toxicidade dos diferentes moduladores contra o fungo A. tenuissima SS77

Antes de iniciar os experimentos de modulação química e epigenética, também foi verificada a toxicidade dos diferentes moduladores contra o fungo A.

tenuissima SS77. Para isso, foi determinada a concentração inibitória mínima

(MIC) desses compostos frente ao fungo.

O experimento de CIM foi realizado em placa de 96 poços. Inicialmente, as substâncias foram solubilizadas em DMSO, obtendo-se soluções iniciais na concentração de 500 mM. 50 µL dessas soluções foram diluídas em 200 µL de PDB (diluição 1:5). Nos primeiros poços foram adicionados 200 µL das soluções preparadas em PDB (100 mM) e nos poços seguintes foram adicionados 180 µL de PDB, exceto no último poço. Fez-se então a diluição em série transferindo-se 20 µL de um poço para o seguinte (diluição seriada de 1:10).

Em seguida, em uma placa de Petri contendo o fungo (7 dias de crescimento), foram adicionados 15 mL de PDB e efetuada a raspagem da superfície. O meio PDB, juntamente com esporos e fragmentos de micélio, foi transferido para um tubo tipo Falcon e homogeneizado. 150 µL dessa suspensão foram transferidos para todos os poços e em seguida, foram adicionados 30 µL do revelador resazurina. Após a adição do inóculo e do revelador, as concentrações finais das substâncias nos poços foram de 50 mM, 5 mM, 500 µM, 50 µM, 5 µM, 500 nM, 50 nM (linhas de H a B da placa, respectivamente). A concentração máxima de DMSO utilizada foi de 10% v:v (primeiros poços). Foi feito um controle de solvente (DMSO), um controle positivo com o antifúngico actidione e um controle negativo, no qual nenhuma substância foi adicionada (apenas meio de cultivo, fungo, água em substituição ao DMSO e revelador). Nas colunas de 1 a 12 da placa foram analisadas, respectivamente, as substâncias ácido suberoidroxâmico (AS), ácido valpróico (AV), butirato de sódio (BS), procaína (P), procainamida (PD), hidralazina (H), iodoacetamida (IO), jasmonato de metila (JM), lovastatina (L), actidione (controle positivo-CP), controle de solvente (CS) e controle negativo (CN, Figura 4). As placas foram colocadas em geladeira (aproximadamente 4 °C) e o crescimento fúngico foi acompanhado durante 5 dias.

Capítulo I – Material e métodos 29

ONa O

actidione (CP)

butirato de sódio (BS)

ácido suberoidroxâmico (AS) ácido valpróico (AV)

procaína (P)- R=O procainamida (PD)- R=NH hidralazina (H) iodoacetamida (IO) lovastatina (L) N N N NH₂ O O HO OH OH azacitidina (AZ) H2N R O N O HO OR O O

ácido jasmônico (AJ)- R=H jasmonato de metila (JM)- R=Me I NH2 O N H O O OH O H N N NH H2N HO H N N H OH O O O O O HO O

Figura 4. Moduladores químicos e epigenéticos utilizados nos experimentos de

modulação.

2.3.2.2.1.3 Efeito da adição de moduladores em cultivos em meio líquido

2.3.2.2.1.3.1 Cultura controle - sem adição de modulador

A cultura estoque do fungo endofítico A. tenuissima SS77 foi reativada em meio PDA (batata, dextrose, ágar). Após 7 dias, cinco fragmentos de micélio- ágar, de 0,5 cm de diâmetro, foram cortados e transferidos, com o auxílio de tubo de transferência da Fisher®, para 75 mL de meio fermentativo de extrato de malte 0,7% (meio previamente selecionado) contidos em um frasco do tipo Erlenmeyer de 250 mL de capacidade. Após 3 dias de cultivo, foram adicionados 100 µL de DMSO ao meio fermentativo. A cultura foi incubada por 11 dias adicionais a 30 ºC sob agitação constante de 120 rpm. Após esse período, foram adicionados 75 mL de EtOH 95% ao meio de cultura, que permaneceu em maceração por aproximadamente 12 horas. O meio foi homogeneizado com aparelho mixer e mantido em ultrassom por 15 min. O micélio foi separado por filtração a vácuo, prosseguindo-se com a partição líquido-líquido da porção hidroalcoólica com Acetato de etila (procedimento repetido 2 vezes). As fases orgânicas foram

30 Capítulo I – Material e métodos

reunidas e concentradas, obtendo-se o extrato da cultura controle do fungo A.

tenuissima SS77. Também foi obtido o extrato do meio de cultura apenas,

seguindo-se os mesmos procedimentos, no entanto, sem adição do fungo, para comparação com o extrato da cultura inoculada com o fungo. Os controles foram realizados em duplicata.

2.3.2.2.1.3.2 Cultura sob modulação química ou epigenética

Os moduladores químicos testados foram os inibidores específicos de vias biossintéticas lovastatina (L) (via do mevalonato), e iodoacetamida (IO) (via dos policetídeos), além do eliciador jasmonato de metila (JM). Os moduladores epigenéticos testados foram os inibidores de HDAC butirato de sódio (BS), ácido suberoidroxâmico (AS) e ácido valpróico (AV), e os inibidores de DNA metiltransferase procaína (P), procainamida (PD) e hidralazina (H). Para realização dos experimentos, o fungo A. tenuissima SS77 foi cultivado e extraído como descrito anteriormente. No entanto, no terceiro dia de cultura fermentativa foi adicionado ao meio de cultivo, individualmente, cada um dos moduladores químicos e epigenéticos mencionados, na concentração final de 50 µM, previamente solubilizados em 100 µL de DMSO. As condições de cultivo e extração foram rigorosamente mantidas para que os resultados obtidos na cultura sob modulação química ou epigenética pudessem ser comparados aos da cultura controle. As substâncias foram avaliadas em duplicata.

2.3.2.2.1.4 Alteração das condições de cultivo em meio líquido para moduladores potencialmente promissores

Esses experimentos foram realizados como descrito previamente para a avaliação do efeito da adição de moduladores em meio líquido, com pequenas variações, já que durante esses últimos experimentos os cultivos foram ampliados. Apenas foram analisados moduladores que apresentaram resultados potencialmente promissores nos primeiros cultivos.

Assim, 12 fragmentos de ágar contendo micélio do fungo de 7 dias foram transferidos para 200 mL de meio fermentativo contidos em um frasco do tipo

Capítulo I – Material e métodos 31

Erlenmeyer de 500 mL de capacidade. Após 3 dias de cultivo, foram adicionadas

ao meio fermentativo as diferentes substâncias solubilizadas em 250 µL de DMSO. As concentrações analisadas também foram diferentes. Hidralazina foi testada nas concentrações finais de 50 µM e 200 µM, iodoacetamida em 100 µM e lovastatina em 500 µM. Todo o restante do procedimento foi feito como descrito anteriormente.

2.3.2.2.1.5 Efeito da adição do modulador 5-azacitidina em cultivos em meio semi-sólido

2.3.2.2.1.5.1 Cultura controle - sem adição de modulador

A cultura estoque do fungo endofítico A. tenuissima SS77 foi reativada em meio PDA (batata, dextrose, ágar). Após 7 dias, três fragmentos de ágar (5 mm de diâmetro) contendo micélio foram transferidos para um tubo de ensaio contendo 5 mL de extrato de malte 0,7% que foi incubado a 30 ºC sob agitação constante de 120 rpm. Após 3 dias, o meio de cultivo líquido foi transferido para a superfície de uma placa de Petri contendo 25 mL de meio de cultivo semi-sólido de extrato de malte 0,7%. A cultura foi incubada em estufa a 30 ºC por 11 dias adicionais. Para realizar a extração, o meio de cultura (ágar e micro-organismo) foi transferido para um recipiente onde foram adicionados 100 mL de metanol e 100 mL de água destilada. Após 12 horas, aproximadamente, o meio foi sonicado por 15 min e filtrado a vácuo. A porção hidroalcoólica foi submetida à partição com acetato de etila (procedimento realizado 2 vezes). As fases orgânicas foram reunidas e concentradas, obtendo-se o extrato da cultura controle.

2.3.2.2.1.5.2 Cultura sob modulação epigenética

O modulador epigenético testado em meio semi-sólido foi o inibidor de DNA metiltransferase 5-azacitidina (AZ, Figura 4). Para realização dos experimentos, o fungo A. tenuissima SS77 foi cultivado e extraído como descrito anteriormente. No entanto, o meio de cultivo líquido foi transferido para a superfície do ágar contendo extrato de malte 0,7% já inoculado com o 5-

32 Capítulo I – Material e métodos

azacitidina, na concentração final de 150 µM, previamente solubilizada em 35 µL de DMSO. As condições de cultivo e extração foram rigorosamente mantidas para que os resultados obtidos na cultura sob modulação epigenética pudessem ser comparados aos da cultura controle.

2.3.2.2.1.6 Efeito da adição de moduladores em cultivos utilizando diferentes meios semi-sólidos e extraídos em micro-escala com diferentes misturas de solventes

2.3.2.2.1.6.1 Cultura controle - sem adição de modulador

A cultura estoque do fungo endofítico A. tenuissima SS77 foi reativada em meio PDA. Após 7 dias, placas de Petri contendo 15 mL de meio de cultivo semi- sólido de PDA ou ágar de extrato de malte a 0,7% foram cobertas com 1,8 mL de solução aquosa de DMSO a 0,24% e deixou-se secar. Em seguida, 1 mL de glicerol a 20% foi adicionado na superfície da placa de Petri contendo o fungo e foi feita a raspagem para remover os esporos, juntamente com micélio. 20 µL dessa suspensão foram transferidos e espalhados na superfície das placas cobertas com solução de DMSO. Além disso, um fragmento (0,5 cm de diâmetro) contendo micélio e ágar foi removido da cultura do fungo e transferido para o centro da placa com DMSO. A cultura foi incubada em estufa BOD a 30 ºC por 14 dias adicionais. Além do controle contendo o meio de cultivo, o fungo e a solução de DMSO, foram feitos controles apenas com o meio de cultivo e controles em que foi adicionado o fungo ao meio de cultivo sem solução de DMSO. A extração dos meios de cultura foi realizada em micro-escala. Para isso, cinco fragmentos de diferentes regiões da placa onde o fungo se desenvolveu foram transferidos para tubos do tipo eppendorf de 1,5 mL de capacidade, e então 1 mL da mistura- solvente Acetonitrila:água 1:1 ou Acetato de etila:isopropanol 1:1 foi adicionado aos tubos. Os fragmentos foram triturados com um bastão de vidro e em seguida, os tubos foram deixados em aparelho de ultra-som por 10 min. O sobrenadante foi transferido para um tubo eppendorf limpo com auxílio de uma pipeta de Pasteur e seco em aparelho de speed vacuum.

Capítulo I – Material e métodos 33

2.3.2.2.1.6.1 Cultura sob modulação química ou epigenética

Os moduladores químicos testados foram os inibidores específicos de vias biossintéticas lovastatina (L) (via do mevalonato), e iodoacetamida (IO) (via dos policetídeos), além do eliciador ácido jasmônico (JM, Figura 4) e o antifúngico actidione (act). Os moduladores epigenéticos testados foram os inibidores de HDAC (enzimas histona-deacetilases) butirato de sódio (BS), ácido suberoidroxâmico (AS) e ácido valpróico (AV), e os inibidores de DNA metiltransferase procaína (P) e hidralazina (H) e 5-azacitidina (AZ). Para realização dos experimentos, o fungo A. tenuissima SS77 foi cultivado e extraído como descrito anteriormente, no entanto, a solução de DMSO adicionada ao meio de cultivo continha, individualmente, cada um dos moduladores químicos e epigenéticos mencionados, na concentração final de 10 µM (actidione e iodoacetamida) ou 100 µM (demais substâncias). As condições de cultivo e extração foram rigorosamente mantidas para que os resultados obtidos na cultura sob modulação química ou epigenética pudessem ser comparados aos das culturas controle.

2.3.2.2.1.7 Obtenção de metabólitos secundários a partir de culturas mistas do fungo A. tenuissima SS77 com Nigrospora sphaerica SS67

Os trabalhos de culturas mistas envolvendo dois fungos endofíticos isolados da mesma planta (Smallanthus sonchifolius), que foram iniciados no mestrado (CHAGAS; DIAS; PUPO, 2013; CHAGAS, 2010), foram prosseguidos durante o doutorado. A partir de extratos de culturas mistas de A. tenuissima SS77 com N. sphaerica SS67, foram isolados três compostos, produzidos por A.

tenuissima SS77, além dos que já haviam sido identificados. Para a obtenção

desses extratos, os fungos foram cultivados como a seguir:

As culturas estoque dos fungos endofíticos A. tenuissima SS77 e N.

sphaerica SS67 foram reativadas meio PDA. Após 7 dias, três fragmentos de

ágar contendo micélio foram transferidos para 10 mL de pré-cultura contendo meio rico em nutrientes (5 g de triptona, 10 g de dextrose, 3 g de extrato de levedura e 10 g de extrato de malte por litro de água), em tubos Falcon de

34 Capítulo I – Material e métodos

capacidade de 50 mL. Os fungos foram mantidos sob agitação constante a 120 rpm, 30 oC, por 7 dias. Após este período, 10 mL das pré-culturas de cada fungo foram transferidos para um mesmo frasco Erlenmeyer de 500 mL de capacidade, contendo 200 mL de meio fermentativo de extrato de malte 0,7%. Foram cultivados um total de quatro frascos de culturas mistas. Essas culturas foram incubadas, nas mesmas condições mencionadas, por um período adicional de 14 dias, seguindo-se a extração.

Foram utilizados dois métodos de extração diferentes. Dois frascos foram extraídos através de resina adsorvente e os outros dois por partição líquido- líquido. Para realizar a extração com resina, no sétimo dia de cultura fermentativa, foram adicionados 10 g de resina adsorvente diaion HP-20 (previamente empacotadas em bolsas de papel de filtro e esterilizadas) aos 200 mL de meio de cultura, e a cultura permaneceu em agitação por mais 7 dias. Após esse período, a resina foi retirada do meio de cultura e extraída. A extração dos metabólitos adsorvidos foi realizada com 100 mL de etanol, através de sonicação em ultrassom por 15 min e filtração a vácuo (procedimento repetido 2 vezes). Em seguida, da mesma forma, foi feita extração com 100 mL de acetona (procedimento realizado uma vez). Ambos os solventes foram reunidos e evaporados, resultando no extrato 1r6777 (60 mg). Na extração por partição, no décimo quarto dia da cultura fermentativa foram adicionados 200 mL de etanol aos 200 mL de meio de cultura. Após 12 horas, aproximadamente, o meio foi homogeneizado em liquidificador e mantido em ultrassom por 15 minutos. O micélio foi separado por filtração a vácuo e foram adicionados 300 mL de água destilada à fração hidroalcoólica, que foi posteriormente submetida à partição líquido-líquido com 700 mL de acetato de etila (volume dividido em 3 procedimentos). As fases orgânicas foram reunidas e concentradas, obtendo-se o extrato 1p6777 (70,5 mg).

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