A análise de mono- sesqui- e diterpenos reveste-se de características específicas, que reflectem a reduzida concentração destes compostos nas plantas (caso particular dos frutos) podendo ir dos picogramas até aos miligramas por quilo,105,106 bem com a enorme
diversidade de características químicas dos componentes. A escolha do método extractivo a utilizar para estes compostos de pequena massa molecular (e baixo ponto de ebulição), tem que ser ponderada. Existem métodos extractivos variados, promovendo cada um alterações qualitativas e quantitativas da composição final do extracto, sem incluir os factores endógenos como a diversidade de composição entre espécies (factores genéticos),106-122
diferentes graus de maturação, ou outros factores externos ambientais e/ou climatéricos, composição do solo, etc. Com o objectivo de serem obtidos extractos que reflictam de um modo mais rigoroso (“fiel”) o teor da matriz original, foram desenvolvidos variados sistemas extractivos como a extracção líquido-líquido,106,108,113,120-152 sólido- líquido,122,141,142,147,149,153-162 a destilação a pressão reduzida,149,157,160,163-171 a hidrodestilação
extracção (SDE)172 (a pressão normal173,174 e a pressão reduzida175-180), a extracção de ”headspace”,166,173,181-184 e mais recentemente, a extracção com fluídos supercríticos, (SFE)185-187
e a microextracção em fase sólida, (SPME).188-190
Nos extractores contínuos SDE o vapor de água é extraído pelo vapor do solvente extractor também em condensação, levando a elevadas taxas de recuperação.190 Este
extractor foi desenvolvido por Likens-Nickerson191,192 (sofrendo posteriores alterações193,194).
De uma maneira geral este processo extractivo decorre à pressão normal mas é possível a utilização a pressão reduzida (minimizando a formação de artefactos proveniente dos compostos mais termolábeis). Pese embora o facto da destilação por arrastamento de vapor ser um método extractivo criticado por alguns autores,173 levando a uma distorção, mais ou
menos acentuada, do perfil da composição de compostos extraídos, visto serem extraídos apenas os compostos que destilam simultaneamente com a água, continua no entanto, a ser o método de extracção mais divulgado na análise destes compostos de pequena massa molecular.115,143,166,194-212
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No que respeita às técnicas de Head-space e Purge & Trap, as críticas apontam para o facto destas técnicas permitirem apenas a recuperação dos metabolitos mais voláteis.213
Quanto à extracção SFE, esta permite o isolamento de compostos semi-voláteis, mas durante o passo de despressurização pode ocorrer discriminação na recuperação dos compostos polares e algumas perdas de metabolitos voláteis.213
A cromatografia gás-líquido de alta resolução (HRGC) e a sua associação à espectrometria de massa são as técnicas mais utilizadas na análise de mono-, sesqui- e diterpenos em misturas complexas.214,215 A análise de matrizes naturais complexas em quantidades pequenas (na ordem dos 10-9 a 10-12 g por quilo de amostra original) é
normalmente efectuada utilizando sistemas cromatográficos que permitem que a amostra após a injecção seja repartida por duas colunas de diferente polaridade possibilitando uma melhor discriminação dos seus componentes, permitindo a “localização” de co-eluições.210
No caso de amostras “ricas em componente volátil” é muitas vezes utilizada a cromatografia líquida em coluna (CC) como método de sub-fraccionamento da mistura anterior à sua análise.141,163 O extracto é sub-fraccionado segundo a polaridade dos
componentes141,154,162,212 (fase normal ou fase reversa), ou segundo a massa molecular dos compostos recorrendo-se para tal à cromatografia de exclusão molecular.159 Deste modo são
obtidas sub-fracções do extracto inicial, de menor complexidade, facilitando a posterior separação cromatográfica e, reduzindo a probabilidade de co-eluições indesejáveis durante a cromatografia gasosa. No entanto, os métodos de sub-fraccionamento têm algumas desvantagens nomeadamente perda de amostra durante o procedimento, produção de artefactos ou ainda a introdução de impurezas. Além disso o fraccionamento nem sempre é previsível.218
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1.3.3.1 GM - MS
ITD versus Quadropólo
Como já foi anteriormente referido a espectrometria de massa, especialmente a sua associação à cromatografia gasosa (GC-MS), tem um desempenho preponderante na identificação da componente volátil das plantas (flores/frutos).
São dois os detectores mais utilizados em GC-MS: o de quadropólo (QMS) e o de armadilha de iões (ITD). O detector de massa “Ion Trap”, ITD, muito popular, em termos conceptuais possui (consideráveis) diferenças em relação ao espectrómetro de massa de quadropólo (QMS), as quais se reflectem nos espectros obtidos.
Figura 1.3.0 Esquema geral de funcionamento dos detectores de massa de quadropólo, QMS.217
Figura 1.3.1 Esquema geral de funcionamento dos detectores de massa de armadilha de iões, ITD incluindo (a) a formação de iões e (b) a filtração mássica. Os três anéis: superior, RF e inferior, fazem parte dos eléctrodos de captura iónica.217
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Nas figuras 1.3.0 e 1.3.1descrevem-se os esquemas gerais de funcionamento dos detectores de massa de quadropólo, QMS (fig. 1.3.0) e de armadilha de iões, ITD (fig. 1.3.1) (neste último, inclui-se o esquema da formação de iões (a) e, da filtração mássica (b)).
O ITD possui um varrimento (scanning) numa gama de massas de 10 a 650 u.m.a. com uma velocidade de varrimento que vai dos 0,125 aos 2,0 segundos/scan por gama de massas seleccionada. O termo espectrometria de massa ITD difere da espectroscopia de massa de quadropólo uma vez que, neste, os iões são guardados (trapped) no sistema de eléctrodos de captura iónica e ejectados selectivamente enquanto que num quadropólo este produz os iões estáveis selectivamente.
A armadilha de iões (IT) ao usar ionização pulsada faz com que os iões sejam criados, armazenados e libertados numa ordem crescente de massas. Em contraste o QMS possui ionização contínua. O facto do IT funcionar numa gama de vácuo inferior (10-2 a 10- 3 torr, hélio em contraste com os 10-5 a 10-6 torr do quadropólo) o que implica a
manutenção dos iões na armadilha (trap), associado ao facto da libertação de iões de determinada massa molecular ser efectuada por um aumento faseado da voltagem de radiofrequência, RF (fazendo com que os iões instáveis saiam da armadilha), faz com que este detector utilize uma superior quantidade de amostra (~50%, enquanto que o quadropólo apenas usa 0,1-0,2% dos iões para análise) resultando numa sensibilidade superior deste detector podendo atingir os 5 pg.
Em contraste, no “ion trap” (ITMS) e com base num “scan” sobrecarregado (figura 1.3.2b) obtém-se como picos minoritários os iões m/z 85, 100, 111 e 129 (M+1), devido a auto-ionização química (space charging). No entanto, da análise do espectro correspondente a um “scan” da frente do pico (figura 1.3.2c), verifica-se a presença do ião molecular (m/z 128) mas o m/z 71 é notavelmente reduzido, quando comparado com o do espectro anterior. Neste caso, nenhum dos “scans” é semelhante ao do espectro obtido em quadropólo.
Além disso, ocorre uma troca abrupta no espectro mostrando um ião m/z 128 pequeno (c), com o ião “space charging” (ião m/z 129). A sobrecarga dos picos pode ser facilmente evitada; no entanto, em relação aos componentes minoritários das amostras (por vezes em concentrações ao nível vestigial) tal não pode ser feito.
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Figura 1.3.2 Comparação dos espectros da 3-metil-4-heptanona obtidos com espectrómetros de massa de quadropólo versus ion trap; (a) Espectro de quadropólo da 3-metil-4-heptanona; (b) Espectro de ion trap da 3-metil-4-heptanona de um “scan” do topo do pico, (conc. elevada); (c) Espectro de ion trap da 3-metil-4-heptanona numa zona do pico não sobrecarregada.
Uma outra técnica on-line para a determinação estrutural de compostos de pequena massa molecular consiste na cromatografia gasosa acoplada ao infravermelho com transformada de Fourier, HRGC-FTIR (“Fourier Transform Infrared”). Esta técnica tem como vantagem a detecção não destrutiva levando à elucidação estrutural de isómeros, de posição e geométricos, em misturas complexas. No entanto na sua utilização surgem por vezes problemas devido à baixa sensibilidade e gama dinâmica quando comparada com a HRGC- MS.219
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