Danilo L. Martins1, Leonardo R. S. Campos1, André M. Ribeiro-dos-Santos3, Ana Carolina M. F.
Coelho1, Renata L. Dantas1, Pitágoras A. A. Sobrinho1, Tetsu Sakamoto1, Amanda F. Vidal3,
Tatiana Vinasco-Sandoval3, Paulo P. Assumpção5, Ândrea K. C. R. Santos3,5, Rodrigo
J. S. Dalmolin1,4, Sandro J. de Souza1,2, Sidney Santos3, Jorge E. S. de Souza1,2*.
1 - BIOME, Bioinformatics Multidisciplinary Environment, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2- Digital Metropolis Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil. 3- Biological Sciences Institute, Federal University of Pará, Belém, PA, Brazil.
4 - Biochemistry Department, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
5 - Núcleo de Pesquisas em Oncologia, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil.
Correspondence: Dr. Jorge E. S. de Souza
47
Figure S1. Distribution of categorized genes according expression levels: Highly Expressed,
Tissue Enriched, Group Enriched, Low Expressed, Mixed Low, Mixed High, Moderate Expressed, Not Significative.
48
Figure S2. Relative expression of tissue specific clusters across tissues. The y-axis of each
graph represents the mean-centered log2 (TPM+1) value. Expression levels of single genes is shown in gray, and the mean expression of the genes in ( a) brain, ( b) pituitary, ( c) kidney, ( d) lung, ( e) heart, ( f) muscle, ( g) ovary, and ( h) testis clusters is shown in blue. The mean expression of genes identified in public data is shown in red for (i ) liver, (j ) skin, (k ) ovary, and (l ) testis.
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Figure S3. Top 10 enriched terms in functional enrichment analysis for (a) brain, (b)
pituitary, (c) kidney, (d) lung, (e) heart, (f) muscle, (g) ovary, and (h) testis.
50
Figure S4. Top 10 highly expressed transcription factors in each tissue-specific cluster along with their scaled mean expression values.
51
Figure S5. Top 10 highly expressed male- and female-biased transcription factors.
52
Table S1. Top 10 ranked differentially expressed genes between males and females of A.
gigas.
Refseq Symbol Description TPM.Female TPM.Male log2FC
XP_018590256.1 LOC108923784 GTP-binding protein Di-Ras2-like 466.060 0 -Inf XP_018589388.2 LOC108923234 retinoid-binding protein 7-like 444.691 0 -Inf KPP79776.1 tubulin-specific chaperone A-like 391.899 0 -Inf XP_029107738.1 fam113 PC-esterase domain-containing protein 1A 167.912 0 -Inf PWS23252.1 hypothetical protein DKP78_14105 111.593 0 -Inf
AKA58770.1 ferritin 103.732 0 -Inf
XP_018598293.2 btg4 maternal B9.15 protein-like 79.007 0 -Inf XP_018613617.1 zp3f.2 zona pellucida sperm-binding protein 3-like 69.878 0 -Inf XP_018617215.1 zglp1 GATA-type zinc finger protein 1 isoform X1 59.001 0 -Inf XP_018621066.1 cpeb1
cytoplasmic polyadenylation element- binding protein 1 isoform X1
55.875 0 -Inf
XP_029113759.1 LOC114912197
uncharacterized protein LOC114912197 isoform X2
0 37.514 Inf
XP_018597916.1 LOC108928463 centrosomal protein of 164 kDa-like 0.079 21.261 8.080 XP_018613905.1 slc1a3a excitatory amino acid transporter 1-like 0.130 32.444 7.959 XP_018601513.1 LOC108930641 cerebellin-1-like 0.3946 87.403 7.794 KPP77175.1 cerebellin-3 precursor-like 2.184 392.873 7.491 XP_018589496.1 LOC108923312 cadherin-20-like isoform X1 0.371 55.960 7.237 XP_018616543.1 dkk1b dickkopf-related protein 1 0.310 40.921 7.045
53
XP_018586657.1 LOC108921611 cortexin-1-like 0.230 26.658 6.856 XP_029110917.1 LOC108932644 neurogenic differentiation factor 6-A-like 0.349 40.284 6.850 XP_018582867.2 si:dkey-1h6.8 uncharacterized protein LOC108919389 0.327 35.812 6.775
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Table S2. KEGG pathway enrichment analysis with p-value ≤ 0.05 of female- and male- biased genes.
ID Description p-value Count Gender
ko04114 Oocyte meiosis 8.986821e-05 8 Female ko04110 Cell cycle 6.230763-04 7 Female ko00480 Glutathione metabolism 4.928937e-04 5 Female ko04914 Progesterone-mediated oocyte maturation 4.225671e-03 5 Female ko04115 p53 signaling pathway 1.045054e-02 4 Female ko00983 Drug metabolism 1.894772e-02 4 Female ko03010 Ribosome 4.625235e-02 4 Female ko00030 Pentose phosphate pathway 3.929582e-03 3 Female ko04020 Calcium signaling pathway 2.398148e-02 4 Male ko04144 Endocytosis 2.780246e-02 4 Male ko04371 Apelin signaling pathway 2.827757e-02 3 Male ko00590 Arachidonic acid metabolism 1.831551e-02 2 Male
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4. DISCUSSÃO
Com o rápido desenvolvimento das tecnologias de sequenciamento de nova geração, as abordagens de sequenciamento de RNA (RNA-seq, do inglês RNA sequencing) abriram um novo caminho para análise de todo o transcriptoma (STARK; GRZELAK; HADFIELD, 2019). Por sua vez, essas análises tem sido amplamente utilizadas, principalmente em peixes de interesse comercial, visando compreender a dinâmica molecular dessas espécies e identificar elementos genômicos funcionais relacionados ao crescimento e metabolismo (LIN et al., 2019; WATANABE et al., 2018; LI et al., 2017). Nesse estudo, utilizamos o RNA-seq de oito tecidos (cérebro, glândula pituitária, rim, pulmão, coração, músculo, ovário e testículo) de dois A. gigas adultos (macho e fêmea) para realizar a montagem do transcriptoma referência de alta qualidade, mediante a estratégia guiada pelo genoma referência (VIALLE et al., 2018), no intuito de identificar genes relacionados a importantes mecanismos bioquímicos e moleculares da espécie.
A montagem do transcriptoma através da abordagem guiada pela referência envolveu primeiramente a filtragem de reads de baixa qualidade e RNA ribossomal com os softwares SICKLE (JOSHI; FASS, 2011) e SortMeRNA (KOPYLOVA; NOÉ; TOUZET, 2012), respectivamente. Em seguida, realizou-se o mapeamento das reads do sequenciamento do transcriptoma no genoma referência através do software STAR (DOBIN et al., 2013), seguida da montagem dos transcritos, associada à evidências extrínsecas de proteínas homólogas, com o software BRAKER2 (HOFF et al., 2019). A abordagem guiada pelo genoma referência gera um modelo gráfico baseado nos mapeamentos para a montagem individual dos transcritos (KOVAKA et al., 2019). Embora essa estratégia seja considerada altamente sensível (MORETON; IZQUIERDO; EMES, 2016), o estado fragmentado do esboço do genoma do A. gigas utilizado e a disponibilidade limitada de genomas devidamente anotados de espécies ortólogas podem ter limitado a identificação de conjunto global de genes, ou mesmo de novos candidatos a genes.
O total de genes reconstruídos foram submetidos a uma pesquisa de homologia de sequência visando fornecer uma anotação abrangente do transcriptoma. A maioria dos genes anotados foram alinhados contra as sequências proteicas da aruanã asiática
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(S. formosus), espécie mais próxima ao A. gigas filogeneticamente. Em seguida, os genes preditos também foram submetidos ao alinhamento contra o banco de dados de proteínas não-redundantes do NCBI. Essa pesquisa de homologia resultou em um total de 23,353 sequências anotadas. Em comparação com um transcriptoma de A. gigas previamente montado pela abordagem de novo por Watanabe et al. (2018), o número e o tamanho médio (1,156 bp, do inglês base pair) das sequências anotadas nesse estudo foram superiores ao registrado no estudo anterior (20,219; 717.97 bp). Essa diferença pode ser atribuída às plataformas de sequenciamento, à estratégia de montagem do transcriptoma, e ao número de tecidos sequenciados. Além disso, esse resultado também se aproximou ao número de genes identificados entre as variedades da aruanã asiática dourada (22,016), vermelha (21,256) e verde (21,524) (BIAN et al., 2016).
Uma vez montado, o transcriptoma foi explorado para obter uma visão geral do perfil transcricional do A. gigas, permitindo a categorização dos genes de acordo com os seus níveis de expressão gênica. Observou-se que uma pequena fração de genes apresentavam expressão exclusiva ou superexpressão em apenas um tecido quando comparada aos demais. O mesmo perfil transcriptômico tecido-específico também foi observado em uma análise comparativa, na qual se realizou a quantificação da expressão gênica em transcriptomas de A. gigas publicamente disponibilizados no NCBI. Foram observados perfis de expressão tecido-específico únicos nos transcriptomas exclusivos (pele e fígado) disponibilizados como dado público. Em contrapartida, os transcriptomas em comum (ovário e testículo), tanto sequenciado nesse estudo como disponibilizado publicamente, apresentaram um perfil de expressão tecido-específico semelhante.
A análise dos dados transcriptômicos de genes tecido-específico são críticos para a compreensão dos mecanismos moleculares que controlam seus respectivos fenótipos (KALETSKY et al., 2018). Portanto, para esses genes tecido-específico, realizou-se análises de enriquecimento funcional visando identificar a função e os possíveis mecanismos moleculares que os mesmos estariam envolvidos. Foram encontrados termos considerados amplamente característicos para cada tecido. Por exemplo, genes músculo-específico foram associados à termos relacionados ao desenvolvimento muscular e contração muscular. Já os genes cérebro-específico, que se apresentaram em maior quantidade (1,423), foram majoritariamente associados a processos neurais, tais como transporte de neurotransmissores e sinalização sináptica.
57
Além disso, observou-se também a existência de padrões de expressão gênica compartilhados entre dois tecidos. A maior sobreposição de genes foi observada entre cérebro e a glândula pituitária (906), seguida de testículo e cérebro (227). Também houve relevante sobreposição de genes entre ovário e cérebro (129). Essa sobreposição é consistente com a coordenação estabelecida entre esses tecidos através do eixo hipotálamo-pituitária-gonadal, ou eixo HPG, que medeia comportamentos reprodutivos (BENTZ et al., 2019).
Por meio da análise dos padrões de expressão gênica diferencial, foi possível identificar potenciais genes candidatos a determinação, diferenciação e manutenção do fenótipo sexual, uma vez que esse mecanismo ainda permanece amplamente desconhecido no arapaima (DU et al., 2019). Observou-se que alguns genes identificados se apresentavam expressos preferencialmente nos testículos em relação aos ovários, ou no conjunto de genes dos tecidos do macho em relação ao conjunto de genes encontrados na fêmea. Por exemplo, o gene dmrta1 (doublesex- and mab-3-related transcription factor A1) se apresentou expresso preferencialmente na glândula pituitária do macho. Este gene parece ser um fator dominante no desenvolvimento do testículo (ADOLFI et al., 2019), bem como na manutenção dos testículos (HERPIN et al., 2013) e a sua ativação promoveu reversão sexual de fêmea para macho no peixe-arroz (Oryzias latipes) (ADOLFI et al., 2019). Outro gene que deve ser destacado é o gata6 (GATA- binding protein 6), que apresentou uma expressão gênica mais elevada no testículo quando comparado aos demais tecidos. Esse gene é um fator de transcrição da família GATA, que desempenha um papel importante na proliferação e diferenciação das células das gônadas, e desenvolvimento do endoderma (LIU et al., 2016). Esse padrão de expressão sexualmente dimórfico também foi observado em outras espécies, como Cynoglossus semilaevis (LIU et al., 2016) e Paralichthys olivaceus (LI et al., 2017).
Observou-se também genes que se apresentavam expressos exclusivamente em machos. Por exemplo, o gene spag6 (sperm associated antigen 6) foi encontrado exclusivamente nos tecidos do macho, e desempenha um papel crucial na motilidade flagelar, através de sua participação essencial na montagem e integridade estrutural da cauda dos espermatozoides (LIU et al., 2019). Esse gene também foi identificado exclusivamente em machos de peixe-gato de cabeça amarela (Pelteobagrus fulvidraco) (LU et al., 2014).
58
Em contrapartida, os genes gdf9 (Growth/differentiation factor 9) e figla (Folliculogenesis specific BHLH transcription factor) apresentaram níveis de expressão gênica mais elevados em ovários quando comparados aos testículos ou quaisquer outro tecido de macho. O gene gdf9 é um fator de crescimento específico para oócitos que demonstra ser essencial para o desenvolvimento folicular (LIU et al., 2011; ZHANG et al., 2014). Esse gene apresentou um padrão de expressão semelhante em outras espécies de peixes, tais como Dicentrarchus labrax (GARCÍA-LOPEZ et al., 2011), Carassius auratus gibelio (LIU et al., 2011; CHEN et al., 2012) e o zebrafish (Danio rerio) (DRANOW et al., 2016; CHEN et al., 2017). Por sua vez, o gene figla é um fator de transcrição responsável por mediar processos de fertilização e embriogênese. Além disso, o figla parece estar envolvido na foliculogênese, sendo responsável por regular genes essenciais para a formação da zona pelúcida em oócitos em crescimento (LI et al., 2016). Na espécie tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), o gene figla parece atuar como um fator antagonista à espermatogênese e, desta forma, contribui para o desenvolvimento ovariano (QIU et al., 2015). Interessantemente, os resultados encontrados na nossa análise não estão de acordo com os achados de Du et al. (2019), que encontraram expressão gênica elevado ou exclusiva em machos do A. gigas. Portanto, o papel desses genes no A. gigas devem ser investigados em estudos posteriores mais detalhados.
O conjunto dos diversos achados mostrados no presente estudo podem auxiliar no desenvolvimento de estudos posteriores mais detalhados, abordando os diversos mecanismos moleculares envolvidos na biologia do A. gigas e, consequentemente, fornecer as informações necessárias para estabelecer esta espécie na aquicultura e auxiliar na restauração dos seus estoques naturais. No entanto, deve-se ressaltar que um número maior de replicatas devem ser incluídas para que resultados mais robustos possam ser gerados (SCHURCH et al., 2016).
59
5. CONCLUSÃO
O Arapaima gigas é uma espécie importante economicamente que apresenta diversas características biológicas particulares. No entanto, a falta de um método fácil e confiável para determinação do sexo ou para acelerar seu desenvolvimento por meio de hormônios ou rações, resultam na restrição do seu cultivo na aquicultura. As descobertas do presente estudo fornecem um transcriptoma de alta resolução com dados valiosos que podem aumentar os recursos genômicos do Arapaima gigas. A variabilidade de tecidos permitiu realizar montagem, anotação e quantificação dos genes mais acuradas, observar a composição transcriptômica do arapaima, que combinado com a evidência de expressão gênica dos perfis de expressão de tecidos de cada sexo, identificou genes e proteínas envolvidos em uma variedade de processos biológicos e que devem ser investigados mais detalhadamente. Esses dados poderão auxiliar no desenvolvimento de estudos posteriores mais detalhados que possam abordar a utilização e desenvolvimento de métodos de sexagem mais confiáveis e o aprimoramento mais eficiente na criação em cativeiro dessa espécie amazônica ecologicamente vulnerável.
60
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