Multiplicação dos juvenis infectantes (JIs)

A emergência de H. amazonensis IBCB 24 em lagartas de G. mellonella diferiu entre os tratamentos pelo teste de Tukey (p<0,05); (ANOVA, F3;18=4,3068; P<0,05), que demonstrou uma variabilidade de 50% entre os tratamentos.

O número de JIs emergidos nas temperaturas de 26°C e 30°C não apresentaram diferenças (229.563 e 127.157), assim como as temperaturas de 18°C e 22°C (11.815 e 223.886). Os maiores números de JIs emergidos foram encontrados em lagartas armazenadas nas temperaturas de 22°C, 26°C e 30°C. Não houve emergência de JIs na temperatura de 14°C (Figura 1).

Na presente pesquisa todas as lagartas exibiram sintomas típicos de morte devido à infecção por Heterorhabditis, especialmente a vermelhidão da cutícula característica causada pelas bactérias simbióticas do gênero Photorhabdus (Boemare, 2002).

4. Discusssão

O estudo do comportamento de nematoides entomopatogenicos em diferentes temperaturas deve ser realizado, pois é reconhecido que a temperatura é um fator importante no ciclo de vida destes agentes (Griffin, 1993). Temperaturas podem variar e ter efeitos sobre a viabilidade dos JIs e sua capacidade de se reproduzir, estes efeitos são observados principalmente em temperaturas extremas 0 e 40°C, que são letais (Rohde et al, 2010;. Susurluk; Ehlers, 2008; Morton; Garcia-del -Pino, 2009). Segundo Koppenhöfer e Kaya (1999), temperaturas entre 20°C e 35°C são adequadas para a patogenicidade, infecciosidade e reprodução de nematoides entomopatogênicos.

A temperatura de 14°C, provavelmente seja crítica para o desenvolvimento dos JIs, devido às lagartas apresentarem um maior período de tempo para mortalidade (oito dias) e sem emergência de JIs ao longo de 30 dias. O nematoide H. amazonensis é uma espécie que se adapta em temperaturas entre 25 a 27°C (Andaló et al., 2006), portanto houve a infecção pelo nematoide, mais não o seu desenvolvimento no cadáver hospedeiro.

Morton e Garcia-del-Pino (2009) e Saunders e Webster (1999) relatam que em temperaturas abaixo de 15°C a taxa de infecção por NEPs não é considerada boa, enquanto em temperaturas entre 15 e 35°C a infectividade é ideal. Morton e Garcia-del-Pino (2009) citam que para algumas espécies de Heterorhabditidae, as temperaturas de 25°C e ou 30°C são considerados ótimos para o desenvolvimento. A espécie H. amazonensis IBCB 24 apresentou a maior infecciosidade a 30°C, com 80% de mortalidade. Yul et al. (2002) observaram que a Steinernema carpocapsae foi patogênico a lagartas de G. mellonella a 13, 18, 24, 30, e 35°C, com a mortalidade mais elevada a 24°C, com o tempo letal sendo diretamente proporcional ao aumento da temperatura.

Hussaini et al. (2005) observaram um relação direta entre o tempo e a temperatura letal e verificaram que entre 25°C e 32°C, juvenis de S. capocapsae causaram 100% de mortalidade em lagartas de G. mellonella e Agrotis ipsilon (Hufnagel, 1766) (Lepidoptera: Noctuidae) a 8°C não houve infecção e 18°C houve uma mortalidade baixa.

Embora cada temperatura possa afetar o percentual de infecção de hospedeiros pelos juvenis infectivos, também pode induzir um impacto diferente sobre o ciclo de vida dentro do hospedeiro (Boff et al, 2001; Susurluk, 2008). O maior período de tempo para a emergência de H. amazonensis IBCB 24 foi a 18°C, quando comparado com o período de tempo da temperatura de 30°C. Morton e Garcia-del-Pino (2009) afirmam que a primeira emergência dos nematoides a 20°C ocorre após 20 dias em temperaturas mais baixa, e após 45 dias após a infecção nas temperaturas mais altas, no entanto, embora o aparecimento dos juvenis de H. amazonensis tenha sido mais tarde, a 18°C, o número de juvenis recuperados são maiores nas temperaturas de 26˚C indicando que esta é a temperatura ótima e favorável para a reprodução e recuperação de JIs, embora não houve diferença com o número de juvenis recuperados a 22 e 30°C. Sáenze e Lopez, (2011), citam que 25°C indica ser uma otima temperatura para o desenvolvimento de NEPs. Isso é consistente com os resultados de Heterorhabditis bacteriophora (Poinar, 1975) e Steinernema rarum (Koppenhöfer; Kaya, 1999; Morton; Garcia-del-Pino 2009).

Heterorhabditis demostram que uma única temperatura não pode ser atribuída ao gênero, e

que a infectividade de espécies de nematoides pode também depender do tamanho da largarta, da profundidade do hospedeiro no substrato e do comportamento de busca dos JIs (Boff et al., 2001; Susurluk; Ehlers, 2008). Adams e Nguyen (2002) confirmam o fato de que o ciclo de vida e o número de gerações de um nematoide depender da disponibilidade de alimento e do tamanho de hospedeiro.

A emergência dos JIs nas temperaturas 18, 22, 26 e 30°C caíram drasticamente no décimo dia de emergência. Quando há um longo período de incubação de cadáveres de insetos, há uma redução da emergência de JIs (Koppenhöfer et al., 1995). Segundo Kaya e Stock (1997), a obtenção de adultos de primeira ou segunda geração de heterorhabditis, é realizada de 3 a 4 dias após a infecção para a primeira geração, de 6 a 9 dias para a segunda geração e 15 ou mais para a terceira geração. H. amazonensis apresentou um ciclo longo, possivelmente com três gerações, mesmo com um número menor de JIs emergidos a 18°C, a emergência estendeu-se mais que 15 dias chegando aos 30 dias ainda com JIs

emergindo dos cadáveres.

Os ciclos de vida de diferentes isolados dependem também da quantidade de inóculo empregado, sendo que lagartas inoculadas com concentração baixa 25JIs/lagarta é uma concentração alta 200 JIs/lagarta apresentam um ciclo de vida longo e curto, respectivamente, resposta possivelmente influenciada pela quantidade de recurso nutricional oferecido pelo hospedeiro (Acevedo et al., 2005). Fato explicado pela intermédiaria concentração inoculada na presente pesquisa, 100 JIs/lagarta, o que proporciona uma baixa competição entre os juvenis para a infecção e com o ciclo

relativamente longo.

Segundo Molina e Lopez (2002) a produção máxima diária de cada espécie de nematoide por hospedeiro apresenta características particulares, a exemplo as produções elevadas de JIs de H. baujardi LPP7 com menores doses aplicadas em lagartas de G.

mellonella (Dolinski et al., 2007). H. megidis Poinar, Jackson & Klein, 1987, isolado

NLH-E 87.3, teve maior produção de JIs em lagartas de G. mellonella na dose de 300 JIs por lagarta e decresceu nas maiores (Boff et al., 2002). No entanto, produções semelhantes foram obtidas com doses entre 20 e 500 JIs em G. mellonella para H. bacteriophora isolado Oswego, reforçando a importância de se conhecer a melhor dose de infecção para as diferentes espécies de NEPs (Flanders et al., 1996). A amplitude da temperatura para o aproveitamento máximo das potencialidades dos

nematoides é relativamente estreita, principalmente na capacidade de infecção e persistências no solo que são comprometidas acima de 30°C e abaixo de 15°C (Kaya, 1990). Esse trabalho colabora com informações importantes sobre o comportamento de H.

amazonensis, com o conhecimento do seu comportamento nas diferentes temperaturas. As

temperaturas de 26°C e 30°C neste experimento foram as melhores para a infecção, emergência e multiplicação em lagartas de G. mellonella. É provável que a característica climática do biótipo onde um isolado se encontra tem um impacto essencial em sua temperatura ideal de infecciosidade (Mrácek et al., 1997; Hazir et al., 2001).

Referências

Acevedo, M. J. P., Moino Junir, A., Cavalcante, R. S., Dolinski, C., Carvalho, F. A. 2005. Patogenicidade, multiplicação e biologia de isolados nativos de nematoides entomopatogênicos (Rhabditida: Heterorhabditidae) provenientes de Lavras, MG. Nematologia Brasileira. 29, 25-30.

Adams, B.J., Nguyen, K. B. 2002. Taxonomy and systematics. In: GAUGLER, R. (Ed.).

Entomopathogenic nematology. New Jersey: Rutgers University. 1-28.

Andaló, V., Nguyen, K. B., Moino Jr. 2006 Heterorhabditis amazonensis n. sp (Rhabditida: Heterorhabditidae) from Amazonas, Brazil. Nematology. 8, 853-867. Boff, M. I. C., Van Tol, R. H. W. M., Smits, P. H. 2002. Behavioural response of

Heterorhabditis megidis towards plant roots and insect lagartae. Bio control. 47, 67-8.

Boff, M. I. C., Smits, P.H. 2001. Effects of density, age and host cues on the dispersal of

Heterorhabditis megidis. Biocontrol Science Technology. 11, 505-514.

Brown, I. M., Gaugler, R. 1997. Temperature and humidity influence emergence and survival of entomopathogenic nematode. Nematologica. 43, 363-375.

Campos-Herrera, R., El-Borarai, F. E., Duncan, L. W. 2012. Wide interguild relationships among entomopathogenic and free-living nematodes in soil as measured by real time Qpcr. Journal of Invertebrate Pathology. 111, 126–135.

Chaston, J., Goodrich-Blair, H. 2010. Common trends in mutualism revealed by model associations between invertebrates and bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34,41-58. Del Valle, E. E, Dolinski, C., Souza, R. M. 2008. Dispersal of Heterorhabditis baujardi

LPP7 (Nematoda: Rhabditida) applied to the soil as infected host cadavers.International Journal of Pest Management. 54, 115-122.

Dolinski, C., Del Valle, E.E., Burla, R.S, Machado, I.R. 2007. Biological traits of two native brazilian entomopathogenic nematodes (Heterorhabditidae: Rhabditida). Nematol Brasileira. 31, 180-185.

Dunphy, G.B., Webster, J. M. 1986. Temperature effects on the growth and virulence of

Steinernema feltiae strains and Heterorhabditis heliothidis. Jounal Nematol. 18,

270-272.

Ehlers. R. U. 2003. Biocontrol nematodes. In: Hokkanen HMT, Hajek AE (eds) Environmental impacts of microbial insecticides. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 177–220.

Flanders, K.L., Miller, J.M., Shields, E. J. 1996. In vivo production of Heterorhabditis

bacteriophora Oswego (Rhabditida: Heterorhabditidae), a potential biological control

agent for soil-inhabiting insects in temperate regions. Journal of Economic Entomology. 89, 373-380.

Goulart, R. M.; Tavares, F. M.; Leite, L. G.; Machado, L. A.; Batista Filho, A.; Almeida, J. E. M. 2003. Formação de um banco de nematoides entomopatogênicos no Instituto Biológico, SP. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, Resumos... São Pedro, 83.

Glazer, I. 2002. Survival biology. 205-220p. In Gaugler R (ed) Entomopathogenic nematology. Wallingford, CABI Publishing UK, 400p.

Grewal, P. S., Ehlers, R.U., Shapiro-Ilan, D.I. (Eds.), 2005. Nematodes as Biocontrol Agents. CABI, New York, NY.

Griffin, C. T. 1993. Temperature responses of entomopathogenic nematodes: implication for the success of biological control programmers. In: BEDDING, R., AKHURST, R. and KAYA, H. (Eds) Nematodes and the biological control of insect pests. EastMelbourne Victoria 3002. 115-126.

Hazir, S., Stock, S. P., Kaya, H. K., Koppenhöfer, A. M., Keskin, N. 2001. Developmental temperature effects on fi ve geographic isolates of the entomopathogenic nematode

Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae). J Invertebr Pathol .77, 243-250.

Hussaini, S. S., Shakeela, V., Dar, M. H. 2005. Infl uence of temperature on infectivity of entomopathogenic nematodes against black cutworm, Agrotis ipsilon (Hufnagel and greater wax moth, Galleria mellonella (Linnaeus) larvae. J Biol Control. 19, 51-57. Hollander, M.,Wolfe, D. A. 1973. Nonparamelric slalislical methods. Chichester & New

York, USA, John Wiley & Sons, 503p.

Kaya, H. K., Stock, S. P. 1997. Techniques in insect nematology, in: L.A. Lacey (Ed.),Manual of techniques in insect pathology, Academic Press, San Diego, CA. 281– 324.

Koppenhoofer, A.M., Kaya, H.K., Taormino, S. P., 1995. Infectivity of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae) at different soil depths and moistures. J. Invertebr. Pathol. 65, 193–199.

Koppenhofer, A.M., Kaya, H.K., 1999. Ecological characterization of Steinernema rarum. J. Invertebr. Pathol. 73, 120–128.

Koppenhöfer, A.M., Grewal, P.S., Fuzy, E.M., 2007. Differences in penetration routes and establishment rates of four entomopathogenic nematode species into four white grub species. J. Invertebr. Pathol. 35, 128–139.

Kaya, H.K., 1990. Soil ecology. In: Gaugler, R., Kaya, H.K. (Eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. CRC Press. 93–116.

Kaya, H. K., Aguillera, M. M., Alumai, A., Choo, H.Y., de la Torre, M., Fodor, A., Ganguly, S., Hazir, S., Lakatos, T., Pye, A., Wilson, M., Yamanaka, S., Yang, H., Ehlers, R.-U., 2006. Status of entomopathogenic nematodes and their symbiotic bacteria from selected countries or regions of the world. Biol. Control. 38, 134–155. Lewis, E. E., Campbell, J., Griffin, C., Kaya, H., Peters, A., 2006. Behavioral ecology of

entomopathogenic nematodes. Biol. Control. 38, 66–79.

Moino Jr, A. Preservação da viabilidade e infectividade de nematoides entomopatogênicos em condições de armazenamento comercial. 2011. 12º SICONBIOL, Simpósio de Controle Biológico “Mudanças climáticas e sustentabilidade: quebra de paradigmas”. 21p.

Molina, J.P., López, J. C. 2002. Desplazamiento y parasitismo de los entomonematodos

Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae) y Heterorhabditis bacteriophora

(Rhabditida: Heterorhabditidae) hacia frutos infestados con la broca del café

Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae). Revista Colombiana de

Entomología. 28, 63-69.

Minas, R.S., Burla, R.S., Machado, I.R., Robaina, R.R., Dolinski, C.M., Souza, R.M. Influência da concentração do nematoide entomopatogênico Heterorhabditis baujardi LPP7 na mortalidade de pupas de Ceratitis Capitata. 2011. Encontro Latino Americano de Pós-Graduação, Iniciação cientifica, Campos de Goytacazes, Rio de Janeiro.

Morton, A., Garcia-Del-Pino, F. 2009. Ecological characterization of entomopathogenic nematodos isolated in stone fruit orchard soils of Mediterranean areas, J. Invert. Pathol. 102, 203-213.

Mracˇek, Z., Becˇvarˇ, S., Rˇ ezacˇ, P., Kindlmann, P., Webster, J.M., 1997. Canadian Steinernematid (Nematoda) isolates and their infectivity, under cold conditions, to greater wax moth (Galleria mellonella) larvae. Biol. Control. 8, 160–164.

Poinar, G. O., Grewal, P. S. 2012. History of entomopathogenic nematology. Journal of Nematology. 44, 153-161.

Rohde, C., Moino Jr. A., Silva, M.A.T., Carvalho, F. D., Ferreira, C. S. 2010. Influence of soil temperature and moisture on the infectivity of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Heterorhabditidae, Steinernematidae) against lagartae of Ceratitis

Ramos-Rodríguez, O., Campbell, J. F., Ramaswamy, S. B. 2007. Efficacy of the entomopathogenic nematode Steinernema riobrave against the stored-product insect pests Tribolium castaneum and Plodia interpunctella. Biol. Control. 40, 15–21.

Susurluck, A., Ehlers, R. U. 2008. Field persistence of the entomopathogenic nematode

Heterorhabditis bacteriopha in different crop. Biocontrol. 53, 627-641.

Saunders, J. E., Webster, J. M. 1999. Temperature Effects on Heterorhabditis megidis and

Steinernema carpocapsae infectivity to Galleria mellonella. Journal of Nematology.

31, 299-304.

Sáenze, A., López, J. C. 2011. Ciclo de vida y patogenicidad de un aislamiento nativo de Heterorhabditis sp., (Rhabditida: Heterorhabditidae). Revista Colombiana de Entomología. 37, 43-47.

Wang, X., Wang, H., Feng, Q. Z., Cui, X. Y., Liu, R. Y., Sun, Y. B., Li, G. C., Song, D. M., Liu, W., Ruan, W. B., Harvey, J. 2014. Desiccation and cold storage of Galleria

mellonella cadavers and effects on in vivo production of Steinernema carpocapsae.Pest Manag Sci. 70, 895–904.

Waal J.Y., Malan, A.P., Levings, J., Addison, M. F. 2010. Key elements in the successful control of diapausing codling moth, Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) in wooden fruit bins with a South African isolate of Heterorhabditis zealandica (Rhabditida: Heterorhabditidae). Biocontrol Sci Technol. 20, 489–502.

Woodring, J. L., and Kaya, H. K. 1988. “Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques.” Southern Cooperative Series Bulletin 331, Arkansas Agricultural Experiment Station, Fayetteville, AR.

White, G. F. 1927. A method for obtaining infective nematode lagartae from cultures.Science. 66, 302-303.

Yul, C., Wonn, L., Sook, Y., Myeong, L., Thi, H. 2002. Effects of temperature and nematodes concentration on pathogenicity and reproduction of entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae Pocheon strain (Nematode: Steinernematidae). Korean J Appl Entomol 41: 269-277.

Tabela 1

Período de mortalidade (dias) de Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) após infecção por Heterorhabditis amazonensis IBCB 24 e período para emergência (dias) de juvenis infectivos em diferentes temperaturas.

T ˚C Mortalidade (dias) Emergência (dias) 14 8,0 [6,8-8,0] b --- 18 7,0 [5,0-7,2] b 24,7 ± 2,8 c (4) 22 5,0 [5,0-8,0] ab 15,7 ± 4,2 b (6) 26 3,0 [3,0-5,0] a 12,0 ± 0,0 bc (4) 30 3,0 [3,0-4,0] a 9,4 ± 2,8 a (8) P 0,001 <0,001

* Médias seguidas de mesma letra minúscula por coluna não diferem pelo teste de Kruskal

Tukey: (p<0,05); (ANOVA, F3;18=4,3068; P<0,05)

Figura 1. Média diária de juvenis infectivos (JIs) de Heterorhabditis amazonensis

IBCB 24 emergidos por lagartas de Galleria mellonela (Lepidoptera: Pyralidae) em cinco temperaturas durante 30 dias.

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Mé di a di á r ia de J Is e m e r g ido s DIAS 30°C (127.157) 26°C (229.886) 22°C (223.886) 18°C (11.815) 14˚C 0

CAPÍTULO III – “Influência da temperatura na sobrevivência de nematoides entomopatogênicos”

Influência da temperatura na sobrevivência de nematoides entomopatogênicos

RESUMO

Nematoides entomopatogênicos são utilizados no controle biológico de insetos, entretanto fatores abióticos como a temperatura podem influenciar na sobrevivência de juvenis infectantes quando armazenados. Com isso o objetivo foi avaliar a influência da temperatura na sobrevivência de juvenis infectantes (JIs) de três espécies de nematoides entomopatogênicos Steinernema carpocapsae IBCB 02, Heterorhabditis amazonensis IBCB 24 e Steinernema feltiae IBCB 47 durante o período de três meses de armazenamento. As populações de cada espécie de NEPs foram acondicionadas em recipientes de polietileno transparente de 500 mL e a concentração utilizada de cada população foi ajustada para 100JI/ml/espécie. Após a inoculação, os recipientes foram armazenados em BOD em temperaturas de 14, 18, 22, 26 e 30°C. A sobrevivência dos juvenis foi verificada aos 5, 10, 15, 30, 60 e 90 dias após a inoculação (DAI), com a retirada de 1 mL da suspensão para a contagem de juvenis vivos e mortos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 30 tratamentos e quatro repetições totalizando 120 parcelas por espécie de NEPs. Os resultados demonstram que as temperaturas de 18 e 22°C foram ideais para a sobrevivência de S. carpocapsae IBCB 02, as temperaturas de 18, 22 e 26°C para as populações de H. amazonensis IBCB 24 e 14, 18 e 22°C, para S. feltiae IBCB 47 permitindo a manutenção da população até 90 dias de armazenamento.

Temperature influence on nematodes survival entomopathogenic

ABSTRACT

Entomopathogenic nematodes are used in the biological control of insects, however, abiotic factors such as temperature may influence the survival of infective juveniles when stored. With that the objective was to evaluate the influence of temperature on survival of infective juveniles (IJs) of three species of entomopathogenic nematodes Steinernema

carpocapsae IBCB 02, Heterorhabditis amazonensis IBCB 24 and Steinernema feltiae

IBCB 47, during three months of storage. The populations of each class of EPNs were placed in polyethylene containers of 500 mL and the concentration used for each population was adjusted to 100 IJ /ml/ species. After inoculation, the containers were stored in BOD at temperatures of 14, 18, 22, 26 and 30°C. The survival of juveniles has been verified to the 5, 10, 15, 30, 60 and 90 days after inoculation (DAI), with the removal of 1 ml suspension for live juvenile counts and dead. The results demonstrate that the temperatures of 18 and 22°C considered optimal for the survival of S. carpocapsae IBCB 02, temperatures of 18, 22 and 26°C for populations of H. amazonensis IBCB 24 and 14, 18 and 22°C to S. feltiae IBCB 47 allowing the maintenance of the population up to 90 days of storage

1. Introdução

Nematoides entomopatogênicos (NEPs) dos gêneros Heterorhabditis Poinar e Steinernema Travassos são considerados ótimos agentes de controle biológico de pragas (Ali; Wharton, 2013). Os juvenis de terceiro estádio (infectantes) não se alimentam e carregam bactérias mutualísticas específicas no intestino. Quando penetra no inseto, libera essas bactérias na hemocele, ocasionado a morte do inseto num período entre 24-48 horas. Esse se alimenta da bactéria e do tecido hospedeiro. Reproduzem-se por duas a três gerações, o juvenil emerge dos cadáveres a procura de novos hospedeiros (Poinar; Grewal,

2012).

Nematoides entomopatogênicos apresentam o tipo de simbiose bastante específica: os gêneros Heterorhabditis e Steinernema são colonizados, exclusivamente, por bactérias dos gêneros Photorhabdus e Xenorhabdus, respectivamente (Winter et al., 2012). Essas bactérias mutualistícas além de produzirem toxinas para matar os insetos, também produzem antibióticos, que lhes permitem crescerem no inseto, livres de outras bactérias e fungos.

Os NEPs apresentam dois tipos de movimentos, o do tipo “emboscada” permitindo-os que alcancem outrpermitindo-os substratpermitindo-os ou hpermitindo-ospedeirpermitindo-os mediante permitindo-os movimentpermitindo-os sincronizadpermitindo-os e ondulatórios do corpo o do tipo “busca”, que buscam o hospedeiro ativamente no solo, se orientando por meio de fatores químio-atraentes, ou seja, por substâncias voláteis liberadas

pelos insetos (Kruitbos et al., 2010).

As estratégias de sobrevivência dos NEPs em condições adversas são pouco conhecidas, podendo estar relacionadas com a permanência do nematoide no solo em estado quiescente, sem gasto energético, ou a sua permanência no cadáver dos insetos por períodos extensos (Glazer, 2002). Os juvenis infectantes dependem unicamente de reservas armazenadas para o seu aprovisionamento energético. Portanto, a conservação de energia é um fator vital para prolongar a sobrevida dos JIs (Qiu et al., 2000).

Muitos são os fatores que podem afetar diretamente ou indiretamente a sobrevivência dos nematoides, entre eles estão; a umidade, tipo de solo, predação e a temperatura (Mason; Hominick, 1995). Cada espécie de NEPs em particularidade apresenta exigências térmicas a qual mais adapta-se para o seu desenvolvimento (Choo et al., 2002). A amplitude da temperatura que permite o aproveitamento máximo das potencialidades dos NEPs como agentes de controle biológico são consideradas relativamente estreitas. A sua capacidade de infecção e persistência no solo são comprometidas por temperaturas

superiores a 30°C e inferiores a 15°C (Kaya, 1990). A preferencia térmica de nematoides dos gêneros Steinernema em campo encontram-se entre 3 a 14°C, e para Heterorhabitidis entre 10 e 16°C (Molineux,1985). As temperaturas acima de 30°C e temperaturas abaixo de 0°C podem afetar negativamente a persistência dos NEPs, isto pode variar entre as diferentes espécies de NEPs e regiões de origem (Smits,1996). Entretanto quase todas as espécies de NEPs são ativas em temperaturas ambientes (25°C ±2).

Armazenamento de nematoides do gênero Steinernema se preservam em temperaturas entre 8˚ e 15°C, sobrevivendo de oito a nove meses, enquanto as espécies do gênero Heterohabditis, sobre as mesmas condições, sobrevivem de três a quatro meses

(Kaya; Stock, 1997).

Estudos sobre os parâmetros que influenciam o período de persistência dos nematoides tornam-se importantes para sua liberação no campo em programas de controle biológico, pois o conhecimento serve para garantir a sobrevivência dos juvenis infectantes no meio ambiente (Brown; Gaugler, 1997).

A sobrevivência de NEPs em condições de laboratório tem sido muito discutida, devido a ocorrência das altas taxas de mortalidade em pouco tempo de armazenamento. A baixa sobrevivência em armazenamento em temperatura ambiente é um dos principais fatores que impede estes agentes de realizar o potencial como bioinseticidas (Grewal, 2002). Assim o objetivo foi avaliar a influência da temperatura na sobrevivência de JIs de três espécies de nematoides entomopatogênicos durante o período de armazenamento.

2. Material e métodos

As espécies de nematoides entomopatogênicos utilizadas foram Steinernema

carpocapsae IBCB 02, Steinernema feltiae IBCB 47 e Heterorhabditis amazonensis IBCB

24 obtidos da Coleção de Nematoides Entomopatogênicos depositados no Banco de Nematoides Entomopatógenos “Oldemar Cardim Abreu” do Instituto Biológico, em Campinas, SP (Goulart et al., 2003). A multiplicação dos nematoides foi realizada no Laboratório de Nematologia, Faculdade de Ciências Agronômicas/UNESP-Botucatu, SP. Os nematoides foram multiplicados com Galleria mellonella criada em temperatura de 30°C com dieta à base de favo e cera de abelha e fotoperíodo de 12 horas. Os isolados dos NEPs foram multiplicados com cinco lagartas de G. mellonella, de terceiro ao quinto ínstar, em placas de Petri ( =9 cm) com duas folhas de papel filtro umedecidas com 1,5 mL de suspensão com 500 JI/placa, disponibilizando 100JI/lagarta. Essas placas foram

lacradas com papel filme PVC e acondicionadas em estufa incubadora tipo BOD com temperatura de 25°C (Woodring; Kaya 1988). Após três dias, as lagartas mortas foram transferidas para armadilha de White (White, 1927) e armazenadas em BOD a 25°C por três a 15 dias. Os JIs que abandonaram os cadáveres foram recolhidos com água destilada, filtrados e decantados para a retirada dos corpos gordurosos dos insetos e quantificados em placas de contagem.

As suspensões das espécies de nematoides foram ajustadas em uma concentração de 100 JI/mL separadamente. Foram individualizadas em recipientes de polietileno transparentes com tampa e com capacidade de 500 ml, e de acordo com os tratamentos e repetições foram inoculados 1mL de suspensão, totalizando um volume de 100 mL de suspensão em cada repetição. As suspensões foram submetidas às temperaturas de 14, 18, 22, 26 e 30°C, em câmara climatizada do tipo BOD sem luminosidade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 30 tratamentos e quatro repetições totalizando 120 parcelas por espécie de NEPs. As avaliações foram feitas aos 5, 10, 15, 30, 60 e 90 dias após a inoculação. A cada avaliação uma alíquota de 1 mL da suspensão de cada repetição foi retirada e vertida em placa de Siracusa graduada para a quantificação de nematoides vivos e mortos. Os nematoides que não apresentavam nenhum tipo de movimento foram induzidos à movimentação com auxilio de alfinete entomológico comum. Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas e