Inicialmente a produção de anticorpo policlonal anti-rTcTAT foi induzida imunizando coelhos com a proteína recombinante como descrito no item 4.13.6. Posteriormente, a expressão da proteína recombinante rTcTAT foi avaliada nas diferentes cepas do T. cruzi através de ensaios de Western blot. Os extratos protéicos totais das formas epimastigotas de diferentes populações do parasita foram submetidos à eletroforese SDS-PAGE (Figura 11A). As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose e incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-rTcTAT. Observamos que o anticorpo foi bastante específico reconhecendo apenas um polipeptídeo com tamanho esperado (~42kDa) para todas as cepas do T. cruzi analisadas (Figura 11B). Como controle positivo utilizamos a proteína recombinante rTcTAT purificada que apresentou uma massa molecular de (~43kDa), cerca de 1kDa maior do que a proteína nativa devido à presença do
hexapeptídeo de histidina. Para melhor quantificar o nível de expressão da proteína incubamos a mesma membrana com anticorpo policlonal de coelho anti-rTcHsP70. O nível de expressão da proteína TcHSP70 em cepas do T. cruzi S/R- BZ foi realizado por Fernanda Freire em sua monografia em 2004, em nosso laboratório. Freire observou que não houve diferença no nível de expressão da proteína TcHsP70 entre cepas sensíveis e resistentes ao BZ.
No ensaio de Western blot foi realizada análise densitométrica utilizando TcHsP70 como normalizador e que as populações de T. cruzi estudadas apresentaram o mesmo nível de expressão da proteína TcTAT, independente do fenótipo de resistência a drogas (Figura 11B). Com intuito de comprovar o nível de expressão da proteína TcTAT, realizamos diluições seriadas de extratos protéicos das populações 17WTS e 17LER (Figura 12A). Após a incubação com anticorpo anti-rTcTAT, foi observado que não há diferença na intensidade da banda entre as populações 17WTS e 17LER (Figura 12B).
Figura 10: Purificação da proteína recombinante rTcTAT fusionada a 6 histidinas. SDS-PAGE 10% corado com Coomassie blue. Utilizamos para purificação uma resina de ácido nitrilotriacético com níquel (Ni2+ - NTA) (canaletas 2 e 3) e a proteína
purificada por eletroeluição (canaleta 4). MM- Marcador de massa molecular (canaleta 1).
Figura 11: (A) Perfil eletroforético das proteínas totais de epimastigotas de populações do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. SDS-PAGE 10% corado por Coomassie blue; MM-Marcador de massa molecular; (B) Western blot utilizando anticorpo policlonal de coelho contra a proteína recombinante rTcTAT e como controle quantitativo incubamos posteriormente a mesma membrana com anticorpo policlonal de coelho contra a proteína recombinante rTcHSP70;
Figura 12: (A) Perfil eletroforético das proteínas totais de epimastigotas das duas populações do T. cruzi diluídas, 17WTS e 17LER. SDS-PAGE 10% corado por Coomassie blue; MM-Marcador de massa molecular; (B) Western blot de extrato proteíco das populações 17WTS e 17LER diluídas 16,32 e 64 x e incubadas com o anticorpo anti-TcTAT;
6 DISCUSSÃO
A quimioterapia da doença de Chagas está restrita ao Benzonidazol (BZ) e ao Nifurtimox (NFX). Ambos os compostos apresentam limitações como à baixa eficácia de cura na fase crônica da doença (8%), efeitos colaterais consideráveis e a existência de cepas naturalmente resistentes. Os mecanismos bioquímicos envolvidos na resistência do T. cruzi a drogas ainda não são conhecidos.
A abordagem proteômica é uma poderosa ferramenta para estudo da função das proteínas (Tyers and Mann, 2003). Estudos proteômicos de resistência a drogas têm identificado proteínas diferencialmente expressas em Helicobacter pylori, Leishmania major e Staphylococcus aureus (McAtee et al.,2001; Drummelsmith et al., 2003; Scherl et al., 2006). Recentemente em nosso laboratório foi utilizado a proteômica (bi-dimensional e espectrometria de massa) para identificar proteínas diferencialmente expressas nas populações do T. cruzi sensíveis (S) e resistentes (R) ao BZ. Na análise do perfil proteômico foram identificadas 27 proteínas superexpressas em populações do T. cruzi R (de Andrade et al., 2005). Neste projeto selecionamos para caracterização a proteína Tirosina Aminotransferase que foi superexpressa em populações do T. cruzi R ao BZ.
As Tirosina Aminotransferases são proteínas chaves em vias metabólicas, pois estão envolvidas na biossíntese, degradação de aminoácidos e metabolismo de carboidratos (Sobrado et al., 2003). Esta enzima catalisa a transferência de uma amina do aminoácido para um cetoácido participando da via metabólica de catabolismo de aminoácidos aromáticos juntamente com uma α-hidroxiácido desidrogenase (Cazzulo et al., 1994).
Em nosso estudo as análises de Northern blot do gene TcTAT mostraram um transcrito de 2,0 Kb para todas as 8 cepas do T. cruzi S ou R analisadas . Estes resultados estão de acordo com os dados descritos por Bomtempi e cols. (1993) que utilizaram a forma epimastigota de clones CA-1/72 e Dm28c e as cepas Tulahuén 2 e RA do T. cruzi. Os resultados de RT-PCR quantitativo em tempo real e Northern blot revelaram um aumento de aproximadamente duas vezes no nível de mRNA do gene TcTAT na população 17LER, comparada com a 17WTS e um aumento de 1,5 vezes desse gene na população BZR comparada com a BZS. Baki e Alexis (1994) relataram aumento de 5 vezes nos níveis de mRNA total e nuclear da TAT em ratos após serem tratados com tetrahidroxi, triamcinolone acetonida e cicloheximida, e
aumento no nível de mRNA da TAT em hepatócitos primários de ratos após tratamento com glucocorticóides. Lopukhina e cols. (2001) reportaram o isolamento e caracterização da TAT da planta, Arabidopsis thaliana, que foi detectada por diferencial display, a partir de plantas tratadas com coronatina, um composto fitotóxico. Os autores observaram aumento nos níveis de mRNA e da proteína da TAT em plantas tratadas com esse composto. Os autores sugerem que a planta sob estresse produz um composto na via da TAT, a prenilquinona, que neutraliza as espécies reativas de oxigênio produzidas. Uma alta concentração deste composto aumenta a atividade da TAT. A maioria das plantas reagem ao estresse pela ativação da trancrição de determinados genes que tem papel na defesa ou no reparo. Hollander-Czytko e cols. (2005) observaram um aumento da atividade da TAT e do Tocoferol (antioxidante) em A. thaliana sob estresse oxidativo. Duret e cols. (2006) observaram que os azóis, antifúngicos, miconazol e ketoconazol inibem a expressão do mRNA da TAT em hepatócitos humanos. Em T. cruzi observamos um aumento no mRNA da TAT das populações resistentes 17LER e BZR, mas que não correspondeu a um aumento do nível de expressão da proteína. Então sugerimos que a ação de estresse produzido pelo BZ possa provocar esse aumento da transcrição da TAT.
Análises do nível de expressão da proteína rTcTAT em cepas do T. cruzi mostraram que o anticorpo policlonal anti-rTcTAT foi bastante específico e reconheceu uma banda de ~42kDa em todas as cepas do T. cruzi analisadas, estando de acordo com os dados da literatura (Bontempi et al.,1993). Nenhuma diferença significativa foi observada no nível de expressão da proteína TcTAT entre as populações analisadas. Entretanto o nível de mRNA do gene TcTAT foi o dobro nas populações do T. cruzi resistentes (17LER e BZR). É possível que processos de trans-splicing, ação de proteasoma, mutações nas regiões 5’ ou 3’ UTR ou degradação do mRNA do gene TcTAT das cepas resistentes possam estar ocorrendo, não produzindo um aumento proporcional da expressão da proteína TcTAT nessas cepas. Alguns estudos reforçam nossa hipótese, pois a regulação da expressão gênica de tripanosomatídeos acontece principalmente a nível pós- transcricional (Vanhame & Pays, 1995). Baki e cols. (1996) mostraram o envolvimento do mecanismo pós-transcricional na regulação do mRNA da TAT em hepatócitos de ratos induzidas por glucocorticóides. Outros estudos mostram a degradação da TAT mediada por sistemas proteolíticos de ubiquitina (Ciechanover et al., 1997; Gross-Mesilaty et al.,1997). Além disso a instabilidade do mRNA pode
contribuir para esta diminuição da proteína uma vez que existem relatos do efeito de fatores de ligação de RNA. No estudo proteômico realizado em nosso laboratório foi identificada a proteína TcTAT como sendo superexpressa na população resistente ao BZ. Entretanto, os nossos resultados de western blot mostram níveis iguais desta proteína nas cepas de T. cruzi analisadas. Isto pode ser devido a pequenas variações na intensidade dos spots observados sejam por variações experimentais na quantificação da proteína. Além disso, os ensaios de western blot apresentam maior sensibilidade para determinar a diferença de expressão da proteína, uma vez que foi utilizado anticorpo policlonal específico anti-TcTAT.
Análises de Southern blot do DNA genômico de 6 cepas do T. cruzi S ou R ao BZ digeridas com endonuclease foram realizadas. O perfil hibridizado com a sonda do gene TcTAT revelou um perfil típico de múltiplas cópias em “tandem”, estando de acordo com dados descritos por Bontempi e cols. (1993) que utilizaram DNA genômico da cepa Tulahuen do T. cruzi. Os autores estimaram o número de cópias do gene TcTAT entre 50 a 80 por parasito com 20 a 25 repetições por arranjos. Outro estudo mostrou que a TAT de T. rangeli apresenta a mesma organização gênica do T. cruzi (Bontempi et al., 2000). A organização genômica apresentada pelo gene TcTAT é muito comum no T. cruzi, pois a maioria dos genes apresentam uma organização em tandem como cisteína-proteinases ubiquitina, proteínas de choque térmico e outros (Campetella et al., 1992; Swindle et al., 1988; Dragon et al., 1987). Por outro lado, alguns genes como o da DNA Topoisomerase II (Fragoso et al., 1992), HGPRT e outros estão presentes em uma única cópia no genoma do parasito. Guimond e cols. (2003) utilizaram a metodologia de microarranjo de DNA para estudar a expressão de 44 genes envolvidos na resistência de Leishmania spp. ao metotrexato. Os autores observaram que desses genes quatro (γ- glutamilcisteína sintetase, P-glicoproteína A, pteridina redutase 1 e dihidrofolato-redutase-timidilato-sintase ) estavam superexpressos e amplificados no genoma dos parasitas resistentes. Enquanto outros três genes (glutationa sintase, S- adenosilhomocisteína hidrolase e S-adenosilmetionina sintase) apesar de estarem superexpressos nos parasitas R, eles não estão amplificados no genoma. Os autores sugerem que mutações nas regiões 5’ ou 3’ UTR podem explicar o aumento no nível de mRNA sem que haja a amplificação desses genes no genoma do parasita. Nossos resultados apesar de mostrarem um aumento do nível de mRNA do gene TcTAT nas populações resistentes do T. cruzi 17LER e BZR, os resultados de
Southern indicam que este gene não está amplificado nas populações 17LER e BZR.
Nossos resultados de cariótipo molecular de 10 cepas do T. cruzi S ou R revelaram que o gene TcTAT está presente em 8 bandas cromossômicas que variaram de 785 a 2500 Kb, concordando com os resultados de Bontempi e cols. (1993) que utilizaram outras 9 cepas. Em nosso estudo não houve relação entre o perfil observado, a resistência a drogas ou zimodema. Henriksson e cols. (1996) no estudo de cariótipo observaram uma grande diversidade no cariótipo entre as cepas do T. cruzi. Essa variabilidade cromossômica pode ocorrer devido à presença de cromossomas homólogos com diferentes tamanhos, à variação do tamanho do telômero ou a ocorrência de pequenas deleções ou inserções.
Em resumo, nossos resultados mostram que a TcTAT não está diretamente associada com o fenótipo de resistência a drogas. Entretanto, isto não exclui que a TcTAT possa atuar via mecanismo compensatório secundário, juntamente com outros genes ou participar de um mecanismo de resposta a estresse produzido pelo BZ. Pois, sabemos que o fenótipo de resistência a drogas em T. cruzi é complexo e pode envolver vários genes e diferentes vias metabólicas.
7 CONCLUSÕES
• O mRNA do gene TcTAT apresentou um aumento na população do T. cruzi com resistência induzida in vitro (2,0x) e selecionada in vivo (1,5x) ao benzonidazol.
• O Gene TcTAT é um gene multicópias organizado em repetições em tandem. Não observamos diferença no número de cópias desse gene entre as cepas sensíveis e resistentes ao BZ;
• O gene TcTAT está localizado em 8 cromossomas que variam de 785 a 2500Kb do T. cruzi e sua localização não está associado como fenótipo de resistência a droga.
• A análise da proteína TcTAT em T. cruzi mostrou que não há diferença no nível de expressão da proteína entre as cepas sensíveis e resistentes.
• Não observamos uma associação direta entre o gene TcTAT e o fenótipo de resistência a drogas em cepas de T. cruzi.
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