nAChRs do subtipo α7

realizar deslocalização eletrônica com o anel da região lateral podem desfavorecer o reconhecimento molecular de modo que as moléculas 19-26, 29 e 32 podem ter uma vantagem nesse quesito. Entretanto, como a função principal do grupo conector é orientar a subunidade lateral do ligante dentro do sítio ativo, é possível que os conectores das moléculas 18, 27, 28, 30 e 33 também possam cumprir esse papel.

Assim, os anéis aromáticos que os ligantes triados possuem podem, através da ação do grupo espaçador, se posicionar favoravelmente dentro da região lateral do sítio ativo.

Até o presente momento, não existem dados na literatura referentes a ensaios farmacológicos das substâncias representadas nas Figuras 27 e 28 frente a esse alvo, o que representa uma oportunidade de descoberta de novos compostos bioativos para o nAChRs do subtipo α3β4.

Utilizou-se o servidor online POCASA para calcular o volume do sítio alostérico transmembranar, que é de 157 ų. A Figura 29 contém uma representação do volume mencionado.

Figura 29 – Regiões que compõem o volume do sítio alostérico transmembranar, localizado na interface α-α dos nAChRs do subtipo α7,e resíduos de aminoácidos que as definem.

Em vermelho tem-se o volume inferior do sítio alostérico, em azul a região superior e em verde a região complementar. A figura b) representa uma rotação de 180º no eixo vertical em relação à figura a).

Na Figura 29, o volume colorido em verde corresponde à uma pequena seção do volume de uma região que existe acima do sítio alostérico transmembranar, sendo que nessa figura o sítio alostérico propriamente dito, correspondendo ao volume de 157 ų, está colorido em azul e vermelho, representando suas regiões superior e inferior, respectivamente. Apesar de não fazer parte do sítio alostérico, o volume em verde, referido daqui em diante como região complementar, foi mostrado para facilitar o entendimento e visualização durante a discussão.

A nomenclatura dos átomos segue o padrão 1:2:3 descrito anteriormente para o subtipo α3β4, pois devido à composição do receptor seus sítios de ligação existem sempre na interface entre duas subunidades do tipo α. Assim, a letra A representa o lado principal do sítio ativo, enquanto a letra B representa o lado complementar.

Inspecionou-se a região do sítio alostérico a fim de observar as interações entre os resíduos de interesse e o ligante 6 co-cristalizado, que foram as seguintes: B:N236 (ligação de hidrogênio não clássica), A:L277, A:M276, A:M301, A:V290, A:294, A:298, B:V274, B:L278, B:P240, B:I244, B:F275 e B:L235, todas estas sendo do tipo hidrofóbicas. O modo de ligação do ligante 6 co-cristalizado está representado na Figura 30.

Figura 30 – Pose do ligante co-cristalizado (6, carbonos em laranja) e resíduos da região do sítio alostérico transmembranar.

Átomos de hidrogênio foram omitidos para maior clareza. A linhas tracejada em amarelo representa átomos envolvidos em uma ligação de hidrogênio não clássica, com a distância sobre o tracejado. Carbonos em azul fazem parte da subunidade α principal (A) e os em verde da subunidade α secundária (B), enquanto os demais átomos seguem o padrão de coloração CPK. PDB ID: 7EKT.

Realizou-se a ancoragem molecular do conjunto de 163 ligantes, obtidos da literatura e construídos conforme descrito na metodologia (seção 3.3), em todas as condições de ancoragem citadas, e os resultados foram utilizados na construção de

modelos dbCICA. Os 10 modelos com maior 5-fold r² estão relacionados na Tabela 6 e a Tabela 7 mostra os contatos críticos apontados pelos 3 melhores modelos.

Tabela 6 – Condições e estatística dos 10 melhores modelos dbCICA para o sítio transmembranar do subtipo α7.

Modelo Função de

Pontuação Ionização

Distância dos contatos(Å)

Contatos

(Positivos_Negativos) 5-fold r²

nAChRs_ α7_1 ASP Sim 2,5 10_10 0,3513

nAChRs_ α7_2 GoldScore Sim 3,5 10_10 0,3428

nAChRs_ α7_3 ASP Não 2,5 7_10 0,3292

nAChRs_ α7_4 ASP Não 2,5 10_10 0,3132

nAChRs_ α7_5 GoldScore Sim 3,5 10_5 0,3123

nAChRs_ α7_6 ASP Não 2,5 9_10 0,3029

nAChRs_ α7_7 GoldScore Não 3,5 10_10 0,2969

nAChRs_ α7_8 ChemPLP Não 2,5 10_10 0,2883

nAChRs_ α7_9 ASP Sim 2,5 8_10 0,2869

nAChRs_ α7_10 ASP Não 2,5 5_10 0,2854

Tabela 7 – Contatos críticos dos 3 melhores modelos dbCICA para o sítio transmembranar do subtipo α7.

Contatos positivos (peso) Contatos negativos

nAChRs_ α7_1

A:I302:CD1 (2), A:L277:HD22 (3), A:M276:HE3 (2), A:M301:HB2 (2),

B:N236:CG (3), B:N236:HA, B:L237:HD12 (3), B:L243:HD11 (2),

B:Y232:HA (3), B:Y233:HE1 (3)

A:A285:HB3, A:I302:HG21, A:L306:HD21, A:T273:OG1, B:N236:HD22, B:I244:HG11,

B:L237:CD1, B:L243:HD13, B:L278:HD22, B:Y232:CE2

nAChRs_ α7_2

A:F297:HB1, A:F297:HB2 (3), A:P291:CG, A:S289:O (2), A:T273:HG23 (2), A:V279:O (2),

B:N236:O (2), B:L231:C, B:F275:CG (3)

A:L269:HG, A:M276:C, A:T286:OG1, A:V290:CG1, B:N236:CB, B:I244:H, B:L235:CD2,

B:L235:O, B:L278:HD22, B:P240:CG nAChRs_ α7_3

A:A298:HB2, A:Q295:HA (3), A:M276:HB1, B:N236:CG (3), B:L237:HD12 (2), B:L243:HD11 (3),

B:P240:HG1 (3)

A:I302:HG21, A:T273:HG23, A:V279:HG12, A:V279:HG13,

B:L247:HD11, B:L247:HD12, B:L278:CD2, B:Y232:HD1,

B:Y232:HH

Nota-se observando os dados da Tabela 6 que a condição de ancoragem que obteve melhor 5-fold r² ocorreu ao utilizar a função de pontuação ASP, com ligantes protonados em pH 7,4 e distância máxima de contatos igual a 2,5 Å. Nessas condições, o valor de 5-fold r² é igual a 0,3513, o que indica que somente 37% da variância de potência percentual presente foi explicada. Esse valor é baixo, mas justificável, uma vez que a variação de atividade do grupo de ligantes é baixa. O parâmetro escolhido como bioatividade para a construção de modelos dbCICA para esse sítio alostérico não foi o pKi, que varia em escala logarítmica, mas sim aumento

percentual de ativação do receptor na presença do PAM quando a ACh (1) atua, o que varia em escala aritmética, e isso resulta em um conjunto de ligantes com menor variação de bioatividade. Dessa forma, é esperado que a correlação entre os contatos críticos e a bioatividade nesse caso seja menos pronunciada em comparação com modelos nos quais se utiliza o pKi como parâmetro. A escolha de PAMs dos tipos I e II como objeto de estudo é uma a limitação intrínseca decorrente da hipótese de que os ligantes utilizados de fato atuam no sítio transmembranar, uma vez que infere-se sobre dados de afinidade (binding) através do ensaio de potenciação percentual da acetilcolina, o que também pode interferir nos valores obtidos para as correlações.

Outro ponto a ser considerado é a ausência das posições dos fosfolipídeos na estrutura utilizada, o que pode resultar em menor correlação devido a ausência de interações relevantes. Levando isso em consideração e tendo em mente que nesta metodologia adota-se a estatística 5-fold r² meramente como métrica para o ranqueamento interno dos modelos, entende-se que o valor baixo é justificável.

A Tabela 6 também mostra que a função de pontuação ASP obteve melhor performance frente as demais, com 6 dos 10 melhores modelos sendo obtidos através do seu uso. A ionização, que está presente em 4 dos 10 modelos mostrados, nesse caso se mostra um parâmetro ambíguo: apesar de estar presente em menos da metade dos modelos, ambos os modelos melhor ranqueados foram obtidos nessa condição. Isso pode ter sido influenciado pela escolha de usar ligantes em forma ionizada na construção dos modelos, já que somente 6 de 163 ligantes foram previstos como aniônicos pelo software MarvinSketch, um grupo pequeno em relação ao total do conjunto. Optou-se por utilizá-los mesmo assim por conta do seguinte raciocínio:

não existem estudos detalhados sobre como ocorre o transporte de ligantes até o sítio alostérico. Visto que esse sítio está próximo da interface da membrana celular, não se pode descartar que ele ocorra por difusão, ao menos para os ligantes com carga neutra. Quanto aos ligantes ionizados, devido à sua natureza iônica, é improvável que tais ligantes cheguem até esse sítio alostérico através de difusão, e a região onde o sítio se localiza se encontra abaixo do filtro de seletividade do canal iônico, i. e., abaixo dos resíduos de aminoácido com carga negativa que compõem a região mais estreita do mesmo, o que também dificultaria sua passagem até o sítio. Entretanto, existe um volume grande (256 ų) localizado logo acima da região do sítio alostérico, voltado para o lado interno do canal iônico, constituído principalmente por resíduos de caráter

polar e ocorrendo em um ponto acessível ao solvente, logo acima da região do filtro de seletividade, por onde os ligantes ionizados poderiam transitar até o sítio. Na ausência de informações adicionais sobre esse transporte, optou-se por introduzir os ligantes ionizados e prosseguir com o cálculo conforme feito para os demais receptores deste trabalho. Portanto, nesse caso em particular, foram analisados os contatos críticos apontados pelos 3 melhores modelos, sendo este terceiro incluído por ser o modelo mais bem ranqueado dentre os que não continham os ligantes ionizados.

Os três modelos melhor ranqueados (Tabela 7) apontaram contatos críticos envolvendo o resíduo B:N236, que também interage com a molécula de referência 6 através de ligações de hidrogênio não clássicas, sendo este contato corroborado pela literatura científica⁵⁰. Esse resíduo também aparece como um contato negativo nos modelos nAChRs_α7_1 e nAChRs_ α7_2. Tanto o modelo nAChRs_a7_1 quanto o modelo nAChRs_ α7_3 indicam presença de contato crítico envolvendo o resíduo M276, com estudos indicando a importância do mesmo para a função de moduladores alostéricos nesse sítio50,57,242,279–281, enquanto modelo nAChRs_ α7_2 aponta esse resíduo como um contato negativo. O contato crítico envolvendo o resíduo B:F275, apontado pelo modelo nAChRs_ α7_2, também está documentado na literatura científica ⁵⁰. O modelo nAChRs_ α7_3 também indica a presença de contato crítico, também presente na literatura científica, envolvendo o resíduo A:Q295^57,242. Dos demais contatos indicados pelos 3 modelos analisados, não foi possível encontrar estudos de mutagênese sítio-dirigida que confirmassem sua importância. Apesar disso, os modelos apontam alguns contatos com resíduos de interesse: o modelo nAChRs_ α7_1 indica contatos críticos com os resíduos A:L277 e A:M301, bem como um contato negativo com o resíduo B:L278. O modelo nAChRs_ α7_2 não indica contatos críticos com resíduos de interesse, apontando somente contatos negativos com os resíduos A:V290, B:I244, B:L235, B:L278 e B:P240. Já o modelo nAChRs_

α7_3 apresenta somente um contato crítico envolvendo um resíduo de interesse, B:P290, e um contato negativo envolvendo o resíduo de interesse B:L278.

Os estudos de mutagênese sítio-dirigida realizados com o intuito de avaliar quais resíduos da região transmembranar dos nAChRs do subtipo α7 são importantes para a modulação alostérica apontam os resíduos M301, M283, M276, S245, S271, L270, T311, F275, N236, G234, A248, L253, Q295, S299, F478, T479 e

C48242,50,57,242,280–282, dentre os quais somente N236, M276, F275 e Q295 foram reconhecidos como contatos críticos pelos modelos dbCICA mostrados. Apesar da importância dos resíduos citados na literatura para a atividade de moduladores alostéricos que atuam nesse sítio, a grande maioria deles não se localiza na região do sítio alostérico transmembranar. Eles estão localizados nas α-hélices transmembranares (M1-M4), porém com exceção dos resíduos M301, M276 e N236, nenhum dos resíduos citados na literatura participam diretamente da composição do sítio ativo. Entende-se que a influência que os mesmos têm sobre a atividade de moduladores alostéricos é consequência de fatores não relacionados diretamente a interações entre os moduladores e tais resíduos, mas sim do efeito que os mesmos têm na estabilização dos estados conformacionais do receptor. As hipóteses mais bem aceitas sobre os mecanismos de ação dos PAMs dos tipos I e II, bem como de NAMs que atuam nessa região, são a potenciação de agonistas do sítio ortostérico através da desestabilização do estado dessensibilizado do receptor, ou a estabilização de seu estado aberto à passagem de cátions, respectivamente^42,283,284. Em ambos as hipóteses, fica claro que as mudanças produzidas por mutações pontuais realizadas nos aminoácidos em questão não indicam resíduos relevantes para o reconhecimento molecular e sim resíduos que influenciam a estabilização ou desestabilização mencionadas. Assim, a baixa concordância entre os contatos críticos apontados pelos modelos dbCICA discutidos nessa seção e os resíduos de aminoácidos considerados importantes para a atividade alostérica nesse subtipo dos nAChRs pode ser justificada. Considerando os dados aqui apresentados, acredita-se que tais resíduos possam ser de fato importantes para o reconhecimento molecular de moduladores alostéricos positivos dos nAChRs do subtipo α7 que atuem no sítio transmembranar, porém mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese.

A molécula de referência 6 foi incluída no conjunto de treinamento dos modelos dbCICA e sua pose de ancoragem obtida nas condições do modelo nAChRs_ α7_1, sobreposta à conformação observada na estrutura experimental, está representada na Figura 31.

Figura 31 – Pose do ligante 6 ancorado (carbonos em ciano) sobreposta ao modo de ligação observado experimentalmente (carbonos em laranja) e resíduos da região do sítio alostérico

transmembranar.

Átomos de hidrogênio, bem como os resíduos B:P240 e B:F275 foram omitidos para maior clareza. A linha tracejadas em amarelo representa átomos envolvidos em ligações de hidrogênio, com a distância sobre o tracejado. Carbonos em azul fazem parte da subunidade α principal (A) e os em verde da subunidade α secundária (B), enquanto os demais átomos seguem o padrão de coloração CPK. PDB ID: 7EKT.

A pose mostrada na Figura 31 recebeu pontuação igual a 28,0123 pela função ASP. Em geral, o posicionamento do ligante PNU-120596 (6) ancorado é similar ao observado experimentalmente, com o grupo carbamida e os anéis isoxazólico e fenila tetrasubstituído localizados nas mesmas regiões e alinhados sobre o mesmo plano em ambos os casos, porém a orientação de cada átomo desses grupos foi distinta. A função de pontuação posicionou as subunidades do ligante orientadas em sentidos opostos sobre o plano no qual as moléculas se encontram, com os átomos apontando em direções contrárias em todos os grupos: na fenila tetrasubstituída, nota-se inversão do posicionamento dos grupos metoxila e do átomo de cloro, similarmente ao que se observa para os heteroátomos do grupo carbamida e do anel isoxazólico.

Por conta dessa inversão, o valor de RMSD obtido foi igual a 4,8209 Å, um valor acima do normalmente aceito como limite para uma pose de ancoragem bem-sucedida, porém no caso em questão valores mais altos são aceitáveis devido à baixa resolução da estrutura utilizada (3,02 Å). As interações previstas foram as seguintes: B:N236 (ligação de hidrogênio), A:A298, A:294, A:A280, A:V290, A:L277, A:M276, B:P240, I:244, B:L235, B:V274, B:L278 e B:F275, sendo estas todas do tipo hidrofóbico.

Entretanto, dentre as interações previstas, somente aquela envolvendo o resíduo A:A280 não é observada na estrutura original. A interação com o resíduo B:N236 é distinta da que se observa na estrutura original, sendo uma ligação de hidrogênio na qual participam uma metoxila do ligante e a cadeia lateral do resíduo, enquanto na estrutura original se observa uma ligação de hidrogênio não clássica entre o oxigênio carbamídico do ligante e o carbono α desse resíduo de aminoácido. Assim, considera-se que essa é uma poconsidera-se de ancoragem válida, uma vez que as interações chave foram reproduzidas.

Tendo como base os resultados obtidos através dos modelos dbCICA, a composição e orientação espacial dos resíduos de aminoácidos do sítio alostérico em questão e considerando a estrutura de alguns ligantes que atuam nesse sítio, é possível racionalizar algumas características favoráveis para o reconhecimento molecular. A Figura 32 mostra um esquema contendo os pontos mais importantes referentes ao reconhecimento molecular de ligantes nesse sítio alostérico.

Figura 32 – Esquema representando as características mais relevantes para o reconhecimento molecular de ligantes dos nAChRs pelo sítio alostérico transmembranar do subtipo α7.

As esferas em azul e magenta representam o volume disponível dentro da região superior do sítio alostérico, que foi dividida em duas metades para facilitar a explicação, as em vermelho o volume da região inferior, e em verde o volume da região complementar.

Para o sítio alostérico transmembranar é importante que os ligantes possuam caráter hidrofóbico, uma vez que resíduos desse tipo são os mais expressivos na região, porém, como revelado pelos dois modelos dbCICA mais bem ranqueados, moléculas negativamente carregadas também podem se mostrar vantajosas.

Entretanto, a maioria dos ligantes que atuam nesse sítio alostérico possuem carga neutra em pH fisiológico, de modo que a hipótese quanto aos ligantes ionizados necessita de mais testes para ser corroborada. Na região superior do sítio alostérico, que é o lado mais interno da região em relação ao canal iônico (em magenta na Figura 32) ligantes contendo anéis aromáticos substituídos podem maximizar interações hidrofóbicas com os resíduos B:L237, B:L278 e A:L277, bem como participar de empilhamentos aromáticos com a cadeia lateral do resíduo B:F275. O volume nessa região permite grupos substituintes pequenos, possibilitando a exploração de substituições nessa região. É possível que substituintes pequenos nas posições meta e para do anel aromático, como halogênios, trifluormetila, metilas e metoxilas, sejam bem aceitos e favoreçam as interações importantes sem perturbar a estabilidade do complexo ligante-receptor. Já no lado mais externo da região superior do sítio alostérico (em azul na Figura 32), grupos hidrofóbicos cíclicos ou aromáticos

poderiam favorecer interações do tipo hidrofóbicas com os resíduos A:M276, B:L235 e A:A294. Devido ao posicionamento da cadeia lateral do resíduo B:N236, acredita-se que tanto grupos aceptores quanto doadores de ligação de hidrogênio poderiam ser explorados nessa região. O oxigênio da cadeia lateral da asparagina pode atuar como aceptor em ligações de hidrogênio enquanto o nitrogênio pode atuar como doador, e a posição do átomo complementar à essas interações no ligante pode ser invertida, visto que a cadeia lateral possui rotações livres. Assim, combinações entre grupos doadores e aceptores podem ser exploradas. Outra possibilidade de interação com esse resíduo envolve a ocorrência de ligações de hidrogênio não clássicas entre um grupo aceptor do ligante e o carbono α do resíduo, simulando o que se observa para o ligante co-cristalizado 6. Seria possível satisfazer tais requisitos introduzindo nessa região subunidades heterocíclicas ou heteroaromáticas que participem das ligações de hidrogênio mencionadas, havendo a possibilidade de atendê-las utilizando grupos substituintes polares e pequenos, bem como carbamidas e tiossemicarbazidas.

A região inferior do sítio alostérico transmembranar pode ser ocupada por grupos capazes de maximizar as interações hidrofóbicas com os resíduos B:P240, B:I244, B:L243, A:A298, A:M301 e B:I302. Anéis aromáticos e não aromáticos substituídos podem cumprir bem esse papel, visto que o volume do sítio ativo parece ser suficientemente grande para acomodar ambas as possibilidades. Grupos contendo enxofre podem apresentar boas interações com o resíduo de metionina, o que pode se mostrar vantajoso.

A região complementar do sítio alostérico transmembranar, em verde na Figura 32, pode ser um ponto importante quando se pensa na otimização das interações de ligantes com esse sítio. Similarmente ao que é observado nas demais regiões já citadas, interações hidrofóbicas são as mais relevantes devido à presença dos resíduos B:L278, B:Y233, B:Y232 e A:A298. Portanto, ligantes que possuam subunidades aromáticas localizadas nesse volume possivelmente terão melhores interações, devido à possibilidade de empilhamentos aromáticos com os resíduos de tirosina mencionados, e ainda mais caso possuam grupos com capacidade de atuar como aceptores de ligação de hidrogênio em interações com esses mesmos resíduos.

Os contatos críticos e negativos apontados pelo modelo nAChRs_α7_1 foram utilizados na construção de um mapa farmacofórico, conforme descrito na

metodologia (seção 3.5). Escolheu-se esse modelo por conta da maior concordância observada quanto aos contatos críticos apontados e os dados da literatura científica.

Os contatos críticos apontados, a sobreposição dos ligantes utilizados para a construção do mapa e o mapa farmacofórico propriamente dito estão representados nas Figuras 33-35.

Figura 33 – Contatos positivos (em verde) e negativos (em azul) apontados pelo modelo nAChRs_α7_1.

Figura 34 – Sobreposição dos ligantes bem-comportados, 10, α7_29, α7_31, α7_41, α7_42, α7_52, α7_54, α7_55, α7_60, α7_78, α7_86, α7_87, α7_102, α7_103, α7_104, α7_105, α7_106, α7_107, α7_113, α7_114, α7_118, α7_121, α7_127, α7_128 e α7_130, dentro do sítio alostérico mostrado na

figura anterior, com os contatos críticos explicitados.

Figura 35 – Mapa farmacofórico do modelo nAChRs_α7_1 referente ao sítio alostérico transmembranar.

Esferas cinzas representam as esferas de exclusão, as em ciano as esferas de característica hidrofóbicas, as em lilás esferas representando átomos pesados, as em laranja grupos aromáticos e as em amarelo esferas de aceptores de ligação de hidrogênio, sendo que a esfera raiada representa a origem do vetor e a esfera opaca a direção para onde o mesmo aponta, quando aplicável.

Construiu-se o mapa farmacofórico com base na complementariedade entre os contatos críticos e a sobreposição dos ligantes, conforme descrito na metodologia (seção 3.5). Devido à proximidade entre a posição dos contatos A:I302:CD1, A:M301:HB2 e B:L243:HD11, que se encontram no volume inferior do sítio alostérico (à esquerda nas Figuras 33 a 35), optou-se por englobar esses 3 contatos em uma mesma esfera de característica hidrofóbica, uma vez que há sobreposição de grupos aromáticos e hidrofóbicos dos ligantes nessa região. O contato com o resíduo A:M276, que está localizado no volume superior externo, também está representado por uma esfera com essa característica. Ainda referente ao volume superior externo, modelou-se duas esferas de característica de aceptor de ligação de hidrogênio para repremodelou-sentar os dois contatos envolvendo o resíduo B:N236, sendo que o par de esferas com vetor direcional representa o contato B:N236:CG e a esfera pontual o contato B:N236:HA.

Optou-se por não utilizar uma esfera com vetor direcional para o contato B:N236:HA porque a maioria dos aceptores presentes nessa região não apontam diretamente para esse átomo. Já para o contato B:N236:CG, o sentido do alinhamento dos átomos aceptores foi mais consistente, o que motivou a utilização do par de esferas com vetor direcional. Na região superior interna, modelou-se uma esfera de átomo pesado para representar o contato A:L277:HD22, pois nessa região houve sobreposição de grupos metila e trifluorometila dos ligantes. Na divisa entre a região complementar e a região superior do sítio alostérico, à direita nas Figuras 33 a 35, modelou-se uma esfera de característica aromática para representar o contato B:L237:HD12. Ao lado dessa esfera, foi construída uma esfera de característica hidrofóbica, representando o contato crítico B:Y233:HE1. O contato crítico B:Y232:HA não recebeu nenhuma esfera de característica porque nenhum dos ligantes potentes e bem-comportados está localizado em suas proximidades.

Em geral, a sobreposição obtida dos ligantes potentes e bem-comportados dentro do modelo nAChRs_α7_1 foi menos consistente do que a obtida em outros modelos utilizados na construção dos demais mapas farmacofóricos dos nAChRs descritos nesse trabalho. Isso pode ser uma consequência da escolha do uso do aumento percentual de ativação do receptor causado pelos PAMs na presença da ACh (1) como parâmetro de bioatividade, uma vez que esse é um parâmetro de variação linear e, portanto, os resultados da variação numérica do parâmetro são

menos pronunciados quanto ao efeito que produzem no receptor. Outra hipótese é que o algoritmo de ancoragem molecular rígido não tenha sido eficiente no posicionamento dos ligantes, uma vez que a estrutura utilizada representa somente um estado estático do domínio transmembranar na conformação ativada, não incorporando a natureza intrinsecamente dinâmica dessa região do receptor in natura.

A capacidade de classificação do mapa foi avaliada através da construção de uma curva ROC, mostrada na Figura 36.

Figura 36 – Curva ROC referente ao mapa farmacofórico construído a partir do modelo dbCICA nAChRs_α7_1 para o sítio alostérico transmembranr. AUC = 0,67, Ya = 0,09 e ACC = 0,62.

Analisados em conjunto, a forma e os parâmetros calculados para a curva mostrada na Figura 36 indicam que a capacidade classificatória do modelo construído é moderada, pois a curva está acima da linha de tendência e possui AUC = 0,67. O parâmetro Ya indica que somente 9% dos ligantes capturados pelo mapa correspondiam a moléculas ativas. A precisão do mapa foi de 0,62, indicando que o modelo classificou corretamente 62% das moléculas contidas no banco de dados.

Assim, acredita-se que o modelo seja robusto o suficiente para a triagem virtual de ligantes com atividade alostérica que atuem no sítio transmembranar dos nAChRs do subtipo α7. De acordo com o mapa, o limite de RMSD ideal para a seleção de ligantes

com potencial atividade alostérica, i. e., o limite no qual a probabilidade de positivos verdadeiros é maximizada enquanto a de falsos positivos minimizada, é igual a 1,042.

Utilizando o mapa farmacofórico validado e o limite de RMSD proposto, obteve-se do banco de dados ZINC20 um conjunto de 112 moléculas, cujas estruturas, códigos ZINC20 e valores de RMSD obtidos estão contidos no Anexo IV-B. As estruturas químicas dos 16 compostos melhor ranqueados estão contidas nas Figura 37 e 38.

Figura 37 – Estruturas químicas das 16 moléculas com menor RMSD na etapa de triagem do banco de dados ZINC20 através do mapa farmacofórico para o sítio transmembranar dos nAChRs do

subtipo α7. Parte 1.

Em azul, a subunidade estrutural que potencialmente ocupará a região superior do sítio ativo, em verde a que ocuparia a região complementar e em vermelho a que poderia ocupar o volume inferior.